Ölçüm% 50 Hemolitik Kompleman (CH ₅₀

Serumun %50 hemolitik kompleman CH 50 aktivitesinin ölçümü. Buz üzerinde saklanmış olan test serumundan 200 mikrolitre ve 1000 mikrolitre aktarabilen pipetlere, sensitize edilmiş koyun eritrositlerine, varon tamponlu saline çözeltisine, distile suya, test serumu için tüplere, bazal ve tam lizis için tüplere, bir vorteks karıştırıcıya ve 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakaya ihtiyacınız olacak. Tüpleri kontrol ve final dilüsyon şeklinde tek tek etiketleyin. Bu durumda, bir sekizde bir dilüsyon ile başlıyoruz.

Kalan tüpleri boş ve total lizis olarak etiketleyerek 1/16, 1/32, 1/64 ve 1/128 dilüsyonlarını oluşturacak şekilde iki katlı dilüsyon işlemine devam edin. Tüm tüpler etiketlendikten sonra, test serumunuzu dilüye etmeye başlayabilirsiniz. Temiz bir tüpe 300 µL R tampon salini aktararak başlayın.

Şimdi 100 µL serumu 300 µL R tampon tuzlu çözeltisine aktarın. Bu işlem, dörtte bir oranında bir Başlangıç seyreltmesi sağlayacaktır. Serum örneğinin iyice karıştırıldığından emin olun.

Şimdi, önceden etiketlenmiş tüplere 200 µL roal tamponlu salin aktarın. Ayrıca, toplam lizis tüplerindeki iki boş tüpe 200 µL roal tamponlu salin ekleyin. Verona tamponlu salin yerine 200 µL distile su ekleyin.

Şimdi, bir bölü dört oranında seyreltilmiş serumdan 200 µL'yi bir bölü sekiz olarak etiketlenmiş tüpe aktarın. Daha önce, bir bölü sekizden bir bölü yüz yirmi sekize kadar olan tüp serisine 200 µL albüminli tuzlu solüsyon aktarmıştık. Bu işlem, şimdi bir bölü sekiz oranında bir seyreltme sağlayacaktır.

Numuneyi iyice karıştırın ve ardından 200 µL'yi 16'da bir olarak etiketlenmiş tüpe aktarın. Tüm tüp serisi seyreltilene kadar bu işleme devam edin. Final hacmi 200 µL olacak şekilde, 1/28 seyreltmedeki tüpten 200 µL'yi atın.

Sensitilize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri zamanla çökmüş olabilir. Tüpün birkaç kez nazikçe altüst edilmesiyle yeniden süspande edilmeleri gerekecektir. Tamamen yeniden süspande edildikten sonra, her bir hazır tüpe 200 µL sensitilize edilmiş koyun kırmızı kan hücresi aktarın.

Serumun eritrositlerle tamamen karıştığından emin olun. Boş tüpe eklenen duyarlı koyun eritrositleri spontan lizisi belirlemenize olanak tanırken, total lizis tüpüne eklenen kan %100 değerini belirlemenizi sağlayacaktır; düşük ayara getirilmiş bir vorteks karıştırıcı kullanarak her bir tüpü nazikçe karıştırın. Şimdi tüpleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe edin.

15 dakikalık inkübasyonun ardından tüpleri tekrar hafifçe vorteksleyin ve 15 dakika daha inkübe edin. İnkübasyon sonrası tüpleri dört santigrat dereceye ayarlanmış bir santrifüje aktarın ve 1500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra tüpleri dikkatlice çıkarın ve uygun bir tutucuya yerleştirin. Burada, SNA kırmızı görünürken kırmızı kan hücrelerinin peletini göreceksiniz.

Hemoglobin transferinin gerçekleştirilmesi için, dokuz veya altı kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın gerekli sayıda kuyucuğuna 100 microliters distile su ekleyin. Peletin transfer edilmemesine dikkat ederek, 100 microliters süpernatanı dokuz veya altı kuyucuklu plakanın uygun bir kuyucuğuna transfer edin. Tüm örnekler plakaya yüklendikten sonra, 540 nanometers değerine ayarlanmış bir plaka spektrofotometresi kullanarak absorbsiyonu ölçün.

Burada, iki replika (A1 ve B1) için ham absorbans verileri yer almaktadır. 1/8 seyreltme oranını baz alınız.

Ardından 16'da bir, 32'de bir, 64'te bir ve 128'de bir olan örneklerin verilerine sahibiz. A6 ve B6 boş kontrollerdir. A7 ve B7 ise toplam lizistir.

Veriler toplandıktan sonra, her bir duble örnek için ortalama absorbansı hesaplamanız gerekir. Ardından, tüm örneklerden, spontan lizisiniz olan kör absorbans değerini çıkarın. Tüm veriler toplandıktan sonra, aşağıdaki formülü kullanarak her bir dilüsyon için yüzde lizis değerini hesaplayabilirsiniz.

Tüm veriler hesaplandıktan sonra, dikey eksende lizis yüzdesini, yatay eksende ise serum dilüsyonunu grafiğe dökün. Elde edilen grafik, sensitize edilmiş koyun kan hücrelerinin %50'sinin lizini için gereken serum dilüsyonunu hesaplamak amacıyla kullanılabilir. Bu grafik, lizis yüzdesinin serumun kat dilüsyonuna karşı çizilmiş halini göstermektedir.

%50 lizis noktasından eğri ile kesişene kadar bir çizgi çizilebilir. Eğrinin kesiştiği noktadan yatay eksene doğru dikey bir çizgi indirilir. Bu değer, %50 lizis sağlamak için serumun kaç kat dilüye edilmesi gerektiğini temsil eder; iki serum örneğini karşılaştırırken CH 50'de bir fark olup olmadığını belirlemek için %50 lizis sağlayan dilüsyon değeri bir ölçüt olarak kullanılabilir.