Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana

Belirli bitki hücre tiplerindeki fitokrom yanıtlarını incelemek için; fitokrom eksikliği oluşturmak amacıyla GAL 4G FP enhancer trap ve U-A-S-B-V-R transgenik hatları çaprazlanır. U-A-S-B-V-R çaprazlamasından elde edilen GA 4G FP progenilerinin yaprak protoplastları bitkilerden izole edilir.

Ardından, GFP negatif ve GFP pozitif protoplastları ayrı örnekler halinde izole etmek için protoplastlar FACS ile ayrıştırılır ve izole edilen protoplastlar konfokal lazer tarama mikroskopisi ile analiz edilir. GFP pozitif protoplastların toplandığını doğrulamak için protoplastlardan RNAlele çıkarılır ve spektral olarak analiz edilir. Merhaba, ben Michigan State Üniversitesi Enerji Bitki Araştırma Laboratuvarı'ndaki BARDA Montgomery laboratuvarından Sanka Pivar.

Bugün sizlere, floresan destekli hücre ayıklama ve hücre tipine özgü gen ekspresyon analizi için Arabidopsis thaliana yapraklarından protoplast izole etme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, doku ve organa özgü fitokrom bağımlı yanıtları incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedürde kullanılan Arabidopsis ANA hattı, iki parçalı bir enhancer trap yaklaşımıyla oluşturulmuştur. Ebeveynlerden biri, farklı gal veya ekspresyon modellerine sahip enhancer trap hatları kütüphanesinden seçilmiştir. Birinci ebeveyn ayrıca, bir upstream activation sequence (UAS) kontrolü altında GFP eksprese etmektedir.

Kısaca, transkripsiyon faktörü GAL4, UAS kontrolü altına yerleştirilen herhangi bir geni aktive eder. Ebeveyn 1 hattında GAL4, GFP'yi aktive eder; ebeveyn 1, ebeveyn 2 ile çaprazlanmıştır. Ebeveyn 2'de BVR geni, UAS aracılığıyla GAL4 kontrolü altındadır.

Çaprazlama sonucunda elde edilen hat U-A-S-B-V-R cross G 4G FP hattıdır. Ebeveyn hatlarda, fitokrom kromofor dört biyosentezi, heme üzerinden LA'dan biver'e (kısaltması bv) doğru ilerler. Ancak döllemede, BVR gen ürünü, BV öncülünü indirgeyerek fitokrom kromofor biyogenezini engeller. Bu enhancer trap BVR döl hattı doğrulanmıştır ve aktif fitokrom seviyelerindeki azalmanın farklı bitki dokularını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.

Bu prosedüre, yaprak protoplastları üretmek amacıyla bitki yetiştirmek için toprak ve saksıları hazırlayarak başlayın. Deney başına örnek başına yaklaşık 2000 sterilize edilmiş tohumu saksılardaki toprağa ekin. Saksıları içeren tepsinin altına su ekleyin ve tüm tepsiyi streç filmle kapatın.

Bitkileri 22 °C ve %70 nem altında, beyaz ışıklandırmada beş hafta boyunca büyütün. İlk beş ila altı günden sonra tohumların çimlendiği teyit edilir ve tepsideki plastik sargı çıkarılır. Protoplastları izole etmek için öncelikle bir litre TEX tamponu hazırlayın; GA's B beş tuzu olan MES, kalsiyum klorür, amonyum nitrat ve sükrozu tartın.

Bileşenleri yaklaşık 900 mililitre deiyonize distile su (kısaltılmış olarak DD H2O) içerisinde tamamen çözün. Ardından, bir molar KOH ile pH değerini 5.7'ye getirin. Sonrasında toplam hacmi bir litreye tamamlayın ve filtre sterilizasyonu yapın.

Ardından, bitkilerden sağlıklı yeşil yapraklar toplayın. Bir behere gevşekçe yerleştirilmiş yaklaşık 250 mililitre yaprak toplayın. Yaprakları 40 mililitre ile durulayın.

20 numara skalpel kullanarak, önce dört kez DD H2O ile, ardından iki kez steril DD H2O ile durulama yapın. Yaprakları ince şeritler halinde kesin ve dokuyu iki adet 50'lik steril plastik tüpe eşit miktarda bölün. 2% ağırlık/hacim mazy R 10 ve 4% ağırlık/hacim cellulase on azua R 10'un TEX tamponunda çözünmesiyle hazırlanan 10 x stok çözeltisinden 5 mL'lik bir alikotu, 45 mL taze TEX tamponuna ekleyerek bir birim yaprak sindirim karışımı hazırlayın.

Yaklaşık 25 mililitre bir x yaprak sindirim solüsyonu ekleyin. Her tüpteki yaprak şeritlerini, tüm yaprak dokusu kaplanacak şekilde karıştırın. Vakum işlemine geçerek, yaprak dokusunu sindirim solüsyonuyla infiltre edin.

Su pompasına bağlı bir vakum desikatörü kullanarak, açık tüplerde oda sıcaklığında bir saat boyunca karıştırın. Işığa maruz kalmasını önlemek için yaprak dokusu ve yaprak sindirim karışımı içeren kapaklı tüpleri alüminyum folyoya sarılı tutun. Ardından, oda sıcaklığında, hafif sallanan bir rocker üzerinde üç saatlik inkübasyon gerçekleştirin.

Üç saat sonra, protoplastları serbest bırakmak için sallayıcı hızını iki dakika boyunca artırın. Kaba protoplast süspansiyonunu, kalıntıları temizlemek için iki kat steril tülbentten süzün ve süzüntüyü steril bir cam behere toplayın. Süzüntüyü steril bir 100 mikrometre naylon elekten geçirerek steril bir Petri kabına süzün.

Akış sıvısını toplayın ve yeni, steril bir 50 milliliter tüpe aktarın. Steril petri kabını yıkamak ve yüzeye tutunmuş olabilecek protoplastları toplamak için yaklaşık 15 milliliter taze TEX tamponu kullanın. Akış sıvısını, ivmelenme altı ve santrifüj işlemi tamamlandığında yavaşlama sıfır olarak ayarlanmış bir salıncak kovalı santrifüj kullanarak 10 degrees Celsius'ta 100 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Yüzen protoplast tabakasını rahatsız etmeden, bu tabakanın altında kalan ve kalıntı ile çökelek debris içeren yaklaşık 25 ila 30 mililitre sıvıyı uzaklaştırmak için peristaltik pompaya bağlı steril dokuz inçlik cam bir pipet kullanın ve geriye yaklaşık 10 ila 50 mililitre sıvı bırakın. Çökelek debris uzaklaştırıldıktan sonra, toplam hacim 40 mililitre olacak şekilde taze TEX tamponu ekleyin. Protoplastları nazikçe yeniden süspande ederken, debris uzaklaştırma ve geri kalan yüzen protoplastların yeniden süspande edilmesi işlemini tekrarlayın.

Hücresel döküntüleri mümkün olduğunca uzaklaştırmak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Santrifüj süresi ilk tekrarda 10 dakikaya, son tekrarda ise beş dakikaya düşürülür. Son olarak, yüzen protoplastları aspire etmek için steril bir mililitrelik transfer pipeti kullanın ve bunları yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Sıralama işlemine doğrudan geçmeden önce, protoplastların bütünlüğünü ve protoplast havuzundaki GFP floresansı varlığını doğrulamak için 488 nanometre uyarım lazeri kullanarak kısa süreli konfokal lazer taramalı mikroskopi (CLSM) ile inceleme yapın. Sıralama nozülünün tıkanmasını önlemek için minimum düzeyde döküntü bulunması gereklidir; izole edilen PROTOPLASTLARI TEX tamponu içerisinde FACS aracılığıyla sıralayın.

Uyarlanmış bir protokol uyarınca, yaklaşık 9 PSI sistem basıncında, 6.000 ile 15.000 arasındaki olay hızlarında, bir makro ayıklama başlığında 200 mikrometrelik bir nozül kullanarak, GFP pozitif protoplastları toplamak için otofloresans eşiklerini belirlemek amacıyla yabani tip non-GFP PROTOPLASTLAR kullanın; hücre ayıklama işlemini, 488 nanometrelik argon hattında 100 miliwatt gücünde çalışan bir argon lazeri ile gerçekleştirin. GFP pozitif protoplastların toplanmasının ardından, GFP floresansını tanımlamak için 530/30 bant geçiren filtre kullanın. Ayıklanan protoplastları, ekspresyon profillemesi için ayıklama işlemi öncesinde olduğu gibi tekrar mikroskop altında inceleyin.

Sıralanmış protoplastlardan toplam RNA ekstrakte edin. Ardından hibridizasyon için cDNA hazırlanabilir. Hazırlanan cDNA, TH one OPSYS Ametri tüm genom dizileri ile hibridizasyona tabi tutulur.

Yaban tip kontrolün protoplast ayrıştırmasına ait bazı temsili sonuçlar burada verilmiştir. Protoplastlar GFP pozitif kapısında herhangi bir sinyal göstermemektedir. Bununla birlikte, GAL 4G FP hatlarından izole edilen protoplast örnekleri için GFP pozitif sinyaller tanımlanmıştır; ayrıştırma öncesinde yaban tip bitkilerden izole edilen protoplastlar CLSM analizlerinde herhangi bir GFP floresansı göstermemektedir.

GAL 4G FP hatlarından alınan protoplast örneklerinde, GFP floresansı gösteren ve göstermeyen protoplastların bir karışımı tespit edilmiştir. CLSM analizi, temsilci bir gal 4G FP hattından GFP pozitif protoplastların izole edildiğini göstermektedir. İzole edilen protoplastlardan RNAle ekstraksiyonu yapılabilir ve bir mililitre, florospektrometri ile tespit için yeterli miktarda RNA sağlar. Size, floresan destekli hücre ayıklama ve hücre tipine özgü gen ekspresyon analizi için atopy ANA'dan yaprak protoplastlarının nasıl izole edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür gerçekleştirilirken, protoplastların işlemleri sırasında nazik davranılmasına ve ışığa maruz kalma sürelerinin sınırlandırılmasına dikkat edilmesi önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.