Name: Deneysel metastaz Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Öğrenin, deneysel metastaz testi ile immün yetmez farelerde kuyruk veninden insan kanser hücreleri enjekte ederek akciğer metastazlarını değerlendirin. Bu yöntem metastatik potansiyeli ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokol, test edilmiş ve Dr. Richard Hynes (MIT) laboratuvar başlangıçta optimize edilmiştir. Finansman NYSTEM FİKİR ÖDÜLÜ (LX) ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (LX) tarafından sağlanmaktadır.

1. Numune Hazırlama <ol><li> ~% 70 büyüme faktörleri veya FBS ile kendi özel medya konfluent (örneğin, MC-1 hücreler için% 10 FBS DMEM) hücreleri büyütün. Plaka medya aspire ve 1 x PBS (8 NaCl Na 2 HPO 4 g / L KCl, 0.2 g / L, 1.15 g / L 0,7 H 2 O, 0.2 g / L KH 2 PO ile hafifçe birkaç kez yıkayın 4, pH 7.3). </li><li> Aspire PBS ve versene% 0.05 tripsin (0.014 g / L fenol kırmızı ve 1 x PBS, pH 7.2 0.2 g / L EDTA-Na) 2 mL ekleyin. Plaka plaka hücre ayrılması kolaylaştırmak için hafifçe sallayın. Hücrelerin mikroskop altında uyun. Genellikle hücreleri ayırmak için 2-5 dakika sürer. </li><li> Tripsin aktivitesi söndürmeye ve 50ml şahin tüp hücreleri toplamak için FBS (veya soya tripsin inhibitörü) içeren medya bol miktarda ekleyin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Temiz bir hemasitometre üzerine hücre süspansiyonu 10μL yükleyin. Ml başına hücre sayısı, ortalama her 10 4 ile çarpılır beş kare içerisinde hücrelerinin eşittir . </li><li> 1000 hücreleri Santrifüj RPM (ya da ~ 200 xg) 3 dakika için bir masa üstü santrifüj. </li><li> Medya hücre pelletini rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Hanks Dengeli Tampon Çözeltisi (HBSS) ~ 5 x 10 6 hücre / ml son bir konsantrasyona ulaşmak için uygun bir hacim hücreleri tekrar </li><li> Falcon 70 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri büyük hücreli agrega dışlamak için. Etiketli 5ml Falcon kültür tüpünün üzerinde doğrudan filtre üzerine pipet ucu yerleştirin. Hızla kültür tüpünün içine filtre ile süspansiyon çıkarır. </li><li> Hemasitometre kullanarak tekrar hücre sayımı ve son konsantrasyonu 2.5 x 10 6 / mL seyreltik. Hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Hücrelerin canlılığı belirleyin. Tripan mavisi ile bazı hücreler Mix ve hemasitometre kullanarak toplam hücreleri üzerinde ölü (mavi) hücrelerinin yüzdesini ölçmek. Hücre canlılığı enjeksiyondan önce ≥% 90 olmalıdır. </li></ol> 2. İntravenöz Enjeksiyon <ol><li> Eldivenleri değiştirin. Yavaşça bir immünyetmezligi fare (çıplak, NOD SCID veya NSG, Jackson Laboratory) kuyruk kapmak ve süzgeç arkasındaki küçük açıklıktan dışarı yapışmasını yarık ve kuyruğunu karşı onun arkasında, fare süzgeç içine onu çekin . </li><li> Halka fare ağız yakalar kez yarık boyunca içe halka yavaşça kaydırın ve yerine kilitleyin. Fare özgürce hareket edebilmek, ancak normal solunum oranına sahip olmalıdır. </li><li> Büyük kuyruk damarlar bul. Dört büyük kan damarlarının bir fare kuyruğu bulunmaktadır. Kuyruk dorsal ve ventral tarafta kan damarları arterler. Damarlar kuyruk yan tarafta. </li><li> 1 ml şırınganın içine hazırlanan hücreler mcL 200'den fazla çizin. 30 G1 / 2 inç iğne takın ve var olabilecek herhangi bir hava kabarcıkları dışarı itmek. Hücrelerin şırınga son hacim 200 mcL (yani, toplam 5 x 10 5 hücreleri) olmalıdır. </li><li> Hücreleri kuyruk damar içine enjekte edilir. <ol class="lalpha"><li> Ilk deneme başarısız olursa, kuyruk daha proksimal bölgeye ikinci bir denemek için kullanılan olabilir, kuyruk distal ucundan başlayın. </li><li> % 70 etanol ile kuyruk silin. Düz kuyruk çekin. Başparmak ile kuyruk ucu tutun ve işaret parmağı ile enjeksiyon noktası desteği. </li><li> Ven iğne takın ve hücreleri enjekte. Iğne ve şırınga enjeksiyon sırasında damar paralel emin olun, aksi takdirde iğne damar duvarı ile karıştırmak ve hücreleri, komşu kuyruk dokulara enjekte. </li><li> Enjeksiyondan sonra iğneyi çekin. Kan, enjeksiyon, enjeksiyon başarıyla giderse bol olmalıdır. Pıhtılaşma kolaylaştırmak için kağıt havlu ya da enjeksiyon yerinde pamuklu temiz bir parça basın ve damar dolaşımı içine herhangi bir kalıntı örnek itin kuyruğu yukarı palpe. </li><li> Süzgeç fareyi bırakın ve kafesine geri dönmek. Bir laboratuar dizüstü (örneğin, kaç denemeler hücreleri enjekte aldı ve ne kadar hücreler enjekte edildi) enjeksiyon işlemi kaydedin. </li><li> Numune Hazırlama Bölümünde açıklandığı gibi, enjeksiyondan sonra hücre canlılığı, belirleyin, 9 adım. Bu adım, hücrelerin enjeksiyon işlemi boyunca hayatta kalmasını güvence sağlar. Bir enjeksiyon deney sonunda, hücre canlılığı azalacak, ancak% 80 üzerinde olmalıdır. </li><li> (Isteğe bağlı) artık hücreleri aşağı Spin ve pelet kez PBS ile yıkayın. Gelecekteki analizler (örneğin, gen ekspresyonu veya knockdowns onaylamak için batı lekeler) -80 ° C'de pelet dondurun. </li></ol></li><li> Genellikle bir veya iki ay sonra, farelerin disseke olacak ve metastaz yerleri kabaca belirlenir. Akciğer, metastaz için birincil site hücreleri sonra ilk karşılaştığınızda bu kapiller yatak içerdiğindendolaşıma girebilir. </li><li> PBS, akciğer (ya da diğer dokular içeren metastaz) her lob ile iyice durulandıktan sonra bir diseksiyon mikroskobu altında (Şekil 1) görülmektedir. Toplam sayısı akciğer metastazları akciğer her iki tarafta saptanabilir metastaz sayısı sayılır ve tüm dört loblar akciğer metastazları sayıları birbirine eklenir. Akciğerlere formalin gecede giderilen eğer 1 akciğer metastazları daha kolay algılanır metastaz bitişik koyu kahverengi akciğer dokusu aksine beyazımsı lekeler olarak apppear beri. </li></ol> 3. Akciğer metastaz Kültürleme Hücreler <ol><li> Akciğer metastazı enjekte edilen farelerin izole edilmiştir. Her biri ayrı kültür olmalıdır. </li><li> Her metastaz 70 mikron hücre süzgecinden (steril) bir iğne kapağı sonuna kadar kıyılmış. </li><li> Orta ve toplanan hücreler bir kültür çanak filtre geçmesine birkaç mL ile hücre süzgeç durulayın. </li><li> Hücreler, rahatsız olmadan en az dört gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Kan veya doku artıkları, tabak PBS ile yıkayın. </li><li> Taze orta ekleyin. Başında, hem kanser hücreleri ve fibroblast hücreleri plakalar üzerinde büyüyecek, ancak yavaş yavaş, fibroblast hücreleri ölecek ve kanser hücreleri tarafından değiştirilmelidir. Kanser hücreleri herhangi bir ilaca dirençli genleri taşıyorsanız, ilgili antibiyotikler ile hücreleri seçin. </li><li> Elde edilen hücrelerin saflık insana özgü proteinlere karşı antikorlar kullanılarak immün değerlendirilir. Biz anti-insan vimentin antikor (NCL-VIM-V9, Novocastra) kullanın. Ilaç seçiminin yokluğunda bile, elde edilen hücrelerin% 99 insan hücreleri üzerinde genellikle içerir. Yeni elde edilen hücrelerin, yukarıda açıklandığı gibi, kendi metastatik yeteneklerini test etmek için bağışık yetmezliği olan farelere tekrar enjekte edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Bu testin sonunda, çok az akciğer metastazı kötü metastatik kanser hücre hattı gelecek bir çok metastatik kanser hücre hattı genellikle birçok akciğer metastazı (Şekil 1), 1 yol açmaktadır. </li><li> Bu yöntemi kullanarak elde edilen hücreler genellikle ebeveyn hat, yine bu testte kullanılarak test daha fazla metastaz neden olmaktadır. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, kanser hücrelerinin kuyruk damar enjeksiyondan sonra fare akciğerlerin Temsilcisi görüntüler . Insan metastatik melanom hücre hattı, SM hücreleri, 4, 5 x 10 5, bağışık yetmezliği olan farelere kuyruk damar içine enjekte edildi. İki ay sonra, akciğerler izole edildi ve metastaz normal akciğer dokusu arasında dağılmış bulundu.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Metastaz, kanser hastalarının ölüm önde gelen nedenidir. Birincil lokusların, dolaşıma giriş (intravasation), dolaşım (ekstravazasyonu) çıkış, ve uzak bir organ hayatta kalma ve büyüme kanser hücrelerinin ayrılması: Bu dört ana adımdan oluşur. Insan metastaz yavaş bir süreç olarak görülür ve genellikle gecikme yıl sonra tezahür eder. Zamanında ilerlemesi çalışma için, yukarıdaki nispeten hızlı deneysel assay bağışık yetmezliği olan farelere kurulmuştur 4 Kurulduğu günden bu yana, farklı metastatik yetenekleri...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin %2,5</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tüpü</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m Hücre Süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Falcon Kültür Tüpü</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12; gauge iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Fare sabitleyici</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pens</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

deneysel metastaz testi

Experimental Metastasis Assay

Metastaz, kanser hastalarının ölüm önde gelen nedenidir. Metastaz mekanizmasını anlamak için, deneysel bir metastaz tahlil bağışık yetmezliği olan farelere kullanılarak kurulmuştur. Bu makale, numune hazırlama, intravenöz enjeksiyon ve akciğer metastaz hücreleri kültür de dahil olmak üzere, bu testte yer alan usul çizmektedir. Kısaca, insan kanser hücreleri önceden belirlenmiş bir sayı hazırlanmıştır.<em&gt; In vitro</em&gt; Ve doğrudan dolaşıma kuyruk damarları aracılığıyla bağışık yetmezliği olan farelere enjekte edildi. Küçük bir hücre sayısı dolaşımda türbülans gibi akciğer gibi iç organlarda metastaz olarak hayatta kalmak ve büyümek. Enjekte edilen farelerin belirli bir süre sonra disseke edilir. Diseksiyon mikroskobu altında metastaz doku dağılımı belirlenir. Belirli bir doku metastaz sayısı ve enjekte edilen kanser hücrelerinin metastatik yeteneği ile doğrudan ilişkilidir. Ortaya metastaz izole ve kültür<em&gt; In vitro</em&gt; Olarak, bağışık yetmezliği olan farelere tekrar enjekte çoğu ebeveyn hat daha gelişmiş metastatik yetenekleri hücre hatları. Bu son derece metastatik türevleri metastatik ilerlemesi düzenleyen genleri veya moleküler yollar tanımlamak için yararlı araçlar haline gelir.

Bu makale, insan kanser hücre hatları metastatik potansiyelini belirlemek için kullanılan deneysel bir metastaz testinin prosedürleri açıklamaktadır.

Deneysel metastaz Testi

Metastaz, kanser hastalarındaki ölümlerin başlıca nedenidir. Metastaz mekanizmasını anlamak için deneysel bir metastaz analizi geliştirilmiştir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kuyruk ven enjeksiyonları yoluyla insan kanser hücrelerinin metastatik yeteneklerini test etmektir. Hücreler, immün yetersiz farelere enjekte edilmek üzere hazırlanır. Ardından hücreler, bir ila iki ay sonra akciğer metastazları oluşturacak olan immün yetersiz farelere enjekte edilir.Fareler diseke edilir, akciğer metastazları sayılır ve kültüre edilir. Bu tip bir analizden elde edilen sonuçlar, belirli bir kanser hücresi tipinin metastaz derecesini gösterir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Genetik Bölümü'ndeki Dr. LE Laboratuvarı'ndan Sonali Mohanty.Bugün size deneysel metastaz analizi gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Kanser metastazını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Yaklaşık %70 yoğunluğa ulaşmış hücrelerle başlayın; plakadaki medyumu aspire edin ve bir kez 1X PBS ile nazikçe yıkayın. Ardından, iki mililitre %0,05 Trypsin ekleyin. Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için plağı nazikçe sallayın.Hücrelerin ayrılmasını mikroskop altında gözlemleyin. Tripsin aktivitesini durdurmak için FBS içeren yeterli miktarda besiyeri ekleyin. Ardından 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hücreler

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare...

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Bu videoda, kolorektal kanser hastadan türetilmiş ksenogreftlerin veya PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Bu ksenogreft modelleri, insan karsinomlarının özelliklerini kısmen taklit eder ve invazyon ve metastaz dahil olmak üzere insan malignitelerinin kritik yönlerini anlar.

Spontan Metastaz Fare Modelleri: Ortototopik Olarak Enjekte Edilen Kolorektal Kanser Hücrelerinin Metastatik Potansiyelini İncelemek İçin Bir Platform

Insan prostat kanser ortotopik bir model akciğer tümör hücreleri ve farklı metastaz oluşumu dolaşan tümör boyutu ölçümü sağlar. Hücreler birincil organı kaçmak gerekir gibi, kan dolaşımına girerek, ve bir ikincil site içine implant, bu modeli etkin insanlarda senaryo tartışıldı.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Bu el yazması tümör hücresi birikimi Akciğerlerde tümör metastazı, bir hayvan modeli ölçmek için bir yöntem açıklanır.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastazı, kanserin virülansında derin bir rol oynar ve ölümlerin tahminen %90'ını oluşturur.  Farelerde metastatik melanom modeli için terapötik ajanların bu klinik fenomene karşı etkinliğini belirlemek için yararlı olan bir protokol sunuyoruz.

Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Öğrenin, deneysel metastaz testi ile immün yetmez farelerde kuyruk veninden insan kanser hücreleri enjekte ederek akciğer metastazlarını değerlendirin. Bu yöntem metastatik potansiyeli ölçmenizi sağlar.

Deneysel metastaz Testi

Daha fazla video keşfet