Deneysel metastaz Testi
24 Ağustos 2010
Bu makale, insan kanser hücre hatları metastatik potansiyelini belirlemek için kullanılan deneysel bir metastaz testinin prosedürleri açıklamaktadır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan kanser hücrelerinin metastatik yeteneklerini kuyruk damarı enjeksiyonları ile test etmektir. İmmün yetmezliği olan farelerde, hücreler enjeksiyon için hazırlanır. Hücreler daha sonra immün yetmezliği olan farelere enjekte edilir ve bu da bir ila iki ay sonra akciğer metastazı oluşturur.
Fareler diseke edilir ve akciğer metastazları ölçülür ve kültürlenir. Bu tür bir testin sonuçları, belirli bir kanser hücresi tipinin metastazlarının derecesini gösterir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Genetik Bölümü'ndeki Dr.LE's Lab'den Sonali Mohanty.
Bugün size deneysel metastaz testi yapmak için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda kanser metastazı incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.
Plakadan yaklaşık %70 Co akıcılık aspire ortamına kadar büyümüş hücrelerle başlayın ve bir XPBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Ardından, iki mililitre% 0.05 Tripsin ters çevirme ekleyin. Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için plakayı hafifçe sallayın.
Hücreleri ayrılırken mikroskop altında gözlemleyin. Etkinlikteki gezileri söndürmek için FBS içeren bol miktarda medya ekleyin. Ardından 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın. Konsantrasyon belirlendikten sonra, hücre peletini bozmadan üç dakika boyunca yerçekiminin yaklaşık 200 katında santrifüjleyin. Mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila altı hücrelik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için uygun bir hacimde Hank'in denge tampon çözeltisini veya HBSS'yi askıya alan ortamı dikkatlice çıkarın.
Ardından, bir Falcon'un 70 mikrometre hücre süzgecinden süzün. Büyük hücre agregalarını dışlamak için, pipetin ucunu doğrudan beş mililitrelik bir kültür tüpünün üzerine yerleştirilmiş filtrenin üzerine yerleştirin. Süspansiyonu filtreden hızlı bir şekilde tüpe çıkarın.
Canlılığı belirlemek için trian mavisi kullanarak hücreleri tekrar sayın. Enjeksiyondan önce canlılık% 90'dan fazla olmalıdır. Daha sonra mililitre başına altı hücreye 2.5 kat 10 katı nihai konsantrasyona seyreltin.
Buz üzerinde tutun. İmmün yetmezliği olan bir farenin kuyruğunu nazikçe tutun ve sırtı yarığa dayanacak ve kuyruğu arkadaki küçük açıklıktan dışarı çıkacak şekilde fare tutucusuna çekin. Halkayı yarık boyunca yavaşça içeri doğru kaydırın.
Yüzük farenin ağzına takıldıktan sonra yerine kilitleyin. Fare serbestçe hareket edememeli, ancak normal bir solunum hızına sahip olmalıdır. Ana kuyruk damarlarını bulun.
Bir fare kuyruğunda dört ana kan damarı bulunur. Arterler kuyruğun dorsal ve ventral taraflarında bulunur. Damarlar yan taraflarda bulunur.
Hazırlanan hücrelerin en az 200 mikrolitresini bir mililitrelik bir şırıngaya çekin. 30 gauge yarım iğne takın ve hava kabarcıklarını dışarı itin. Şırıngadaki son hacim 200 mikrolitre olmalıdır.
Kuyruğun distal ucuna enjekte etmeye hazırlanın. Bu nedenle, ilk deneme başarısız olursa, ikinci bir deneme için kuyruğun daha yakın bir bölgesi kullanılabilir. Enjeksiyon bölgesini %70 etanol ile sildikten sonra kuyruğu düz bir şekilde çekin.
Ucu başparmağınızla tutun ve işaret parmağınızla enjeksiyon noktasını destekleyin. İğneyi damarın içine sokun ve hücreleri enjekte edin. Enjeksiyon sırasında iğne ve şırınganın damara paralel olduğundan emin olun.
Aksi takdirde, iğne damar duvarından geçecek ve hücreler bitişik kuyruk dokularına enjekte edilecektir. İşlem başarılı bir şekilde gittiyse iğneyi geri çekin. Kan, enjeksiyon bölgesinden perfüze edilmelidir.
Diş ipi kullanımını kolaylaştırmak için temiz bir pamuğa bastırın ve kalan numuneyi dolaşıma itmek için kuyruğu yukarı doğru palpe edin. Fareyi sınırlayıcıdan serbest bırakın ve kafese geri koyun. Enjeksiyon denemelerinin sayısını ve enjekte edilen hücre sayısını bir laboratuvar not defterine kaydedin.
Enjeksiyondan sonra hücrelerin canlılığını belirleyin. Daha önce olduğu gibi, bu adım hücrelerin enjeksiyon işlemi boyunca canlı kalacağına dair güvence sağlar. Bir enjeksiyon deneyinin sonunda, hücrelerin canlılığı azalacak, ancak %80'in üzerinde kalmalıdırİsteğe bağlı bir adım olarak, kalan hücreleri aşağı doğru döndürün ve peletleri PBS ile bir kez durulayın.
Ardından, batı lekeleme gibi gelecekteki analizler için peletleri eksi 80 santigrat derecede dondurun. Knockdown'larda gen ekspresyonunu doğrulamak için Bir ila iki ay sonra, metastazların yerlerini belirlemek için fareleri inceleyin. Ötenazi fareyi bir diseksiyon istasyonuna yerleştirerek başlayın.
Fareye cömertçe etanol püskürtün. Akciğerleri ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Sonra bunları dikkatlice kesin ve PBS'ye yerleştirin.
Akciğer, hücrelerin karşılaştığı ilk kılcal yatağı içerdiği için metastaz için birincil bölgedir. Dolaşıma girdikten sonra, kalbi çıkarın ve akciğerleri PBS'de durulayın, ardından akciğerin her bir lobunu diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. Akciğerin her iki tarafındaki saptanabilir metastaz sayısını, ardından toplam akciğer metastaz sayısını belirlemek için dört lobun tümündeki akciğer metastaz sayılarını sayın.
Daha sonra, makas kullanarak eksizyon ile bireysel akciğer metastazlarını izole edin. Her metastazı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine aktarın ve steril bir iğne kapağının ucunu kullanarak kıyın. Hücre süzgecini birkaç mililitre ortamla durulayın ve filtreden geçen hücreleri toplayın.
Bir kültür kabında, her çanak bir metastazından hücreleri içerir. Hücreleri rahatsız etmeden en az dört gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Başlangıçta, hem kanser hücreleri hem de fibroblast hücreleri plakalar üzerinde büyüyecek, ancak yavaş yavaş fibroblast hücreleri ölecek ve yerini kanser hücreleri alacaktır.
Kanser hücreleri ilaca dirençli herhangi bir gen taşıyorsa, karşılık gelen antibiyotikli hücreleri seçin Üç gün sonra, kan veya doku kalıntılarını, tabak üzerindeki kalıntıları PBS ile yıkayın ve taze ortam ekleyin. Burada insana özgü proteinlere karşı antikorlarla immüno-boyama yaparak türetilmiş hücrelerin saflığını değerlendirin ve ilaç seçimi olmadığında bile insan karşıtı antikor kullanılır. Hücrelerin %99'undan fazlası insan olmalıdır.
Yeni türetilmiş hücreler, bu testin sonunda metastatik yeteneklerini test etmek için immün yetmezliği olan farelere tekrar enjekte edilebilir. Yüksek metastatik bir kanser hücre hattı tipik olarak birçok akciğer metastazına yol açarken, çok az akciğer metastazı zayıf metastatik bir kanser hücre hattından gelir. Bu görüntüler, insan melanom hücre hattının enjeksiyonundan iki ay sonra akciğer metastazlarını göstermektedir.
Bir 3 7 5 sm. Bu yöntem kullanılarak elde edilen hücreler, test edildiklerinde genellikle ebeveyn hattından daha fazla metastaza yol açar. Yine bu testi kullanarak, size deneysel metastaz testi gerçekleştirme prosedürünü gösterdik.
Bu prosedürü yaparken, hücrelerin kuyruk damarına enjekte edildiğinden, ancak onun ve kuyruk dokusuna enjekte edilmediğinden emin olmayı unutmamak çok önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, immün yetmez farelerde kuyruk damarı enjeksiyonları yoluyla insan kanser hücre dizilerinin metastatik potansiyelini değerlendirmek için kullanılan deneysel metastaz testini açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- Metastaz Araştırması
- Deneysel Biyoloji
Arka Plan
- Kanser metastazını anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir.
- Deneysel testler, kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini ölçmeye yardımcı olur.
- İmmün yetmez fareler, insan kanser hücre davranışı çalışmaları için uygun bir model sağlar.
- Kuyruk damarı enjeksiyonları, akciğer metastazlarını değerlendirmek için yaygın bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- İnsan kanser hücrelerinin metastatik yeteneklerini test etmek.
- Enjekte edilen hücrelerden oluşan akciğer metastazlarını ölçmek ve kültür etmek.
- Farklı kanser hücre dizilerinin metastatik potansiyeli hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Enjeksiyon için insan kanser hücrelerinin hazırlanması.
- Hücrelerin immün yetmez farelerin kuyruk damarına enjekte edilmesi.
- Bir ila iki ay boyunca akciğer metastazlarının gelişiminin izlenmesi.
- Akciğer metastazlarını ölçmek ve kültür etmek için farelerin diseksiyonu.
Ana Sonuçlar
- Enjekte edilen kanser hücrelerinden başarılı bir şekilde akciğer metastazlarının oluşturulması.
- Metastazların ölçülmesi, metastatik potansiyel hakkında veri sağlar.
- Kültür edilen metastazlar daha fazla analiz için kullanılabilir.
- Sonuçlar, farklı kanser hücre dizileri arasında metastatik yeteneklerde değişkenlik olduğunu gösterir.
Sonuçlar
- Deneysel metastaz testi, kanser hücre davranışı değerlendirmek için etkilidir.
- Elde edilen bilgiler, metastatik kansere karşı terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Bulgular üzerine yapılan daha fazla çalışma, altta yatan mekanizmaları araştırmak için temel oluşturabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The experimental metastasis assay provides a quantitative in vivo model to assess the metastatic potential of human cancer cell lines, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling the isolation and propagation of highly metastatic derivatives, the assay facilitates the identification of genes and pathways regulating metastatic progression, thereby informing lead identification and preclinical prioritization. This approach enhances predictive confidence in downstream therapeutic development by linking in vitro findings to functional metastatic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying metastatic ability of cancer cells following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo readout for functional target validation in metastasis-relevant pathways.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular alterations to metastatic phenotypes in immunocompromised mice.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metastasis counts that serve as dependent variables for screening modulators of metastatic dissemination.
- Operational Value: Standardizes cell preparation, injection, and tissue harvesting procedures to ensure reproducibility across experiments.
- Scientific Value: Enables derivation of metastatic cell lines with enhanced invasive properties for use in secondary screening and target deconvolution.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system where lung metastasis formation mirrors clinical patterns of hematogenous spread.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing re-injection of cultured metastases to assess stability of the metastatic phenotype.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery by enabling molecular profiling of isolated metastases compared to parental lines.
Pipeline & Workflow Integration
The assay functions as a discovery-stage tool that bridges target hypothesis testing with phenotypic validation, informing decisions on compound progression and mechanistic follow-up in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of metastasis regulators through quantitative lung colonization assays.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (metastasis number per lung) enabling comparison across genetic or chemical conditions.
- Analytics: Generates count-based data suitable for statistical analysis to determine significant differences in metastatic potential.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by providing a model that reflects organ-specific metastatic tropism.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating metastatic capacity across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by demonstrating causal links between gene modulation and metastatic suppression or enhancement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell viability thresholds (>90% pre-injection, >80% post-injection) and standardized injection volumes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional metastasis data that complements in vitro invasion and proliferation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated effect on metastatic burden in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, intravenous injection techniques, and aseptic tissue dissection.
- Dependent on access to immunodeficient mouse models and facilities for long-term animal housing (one to two months).
- Necessitates standardized protocols for cell preparation, viability assessment, and metastasis quantification to minimize variability.
- Involves technical considerations for metastasis isolation, including enzymatic or mechanical dissociation and filtration to obtain single-cell cultures.
- Limited to modeling early dissemination and lung colonization; does not capture later stages of metastasis such as extravasation or distant organ growth beyond the lung.
