Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Merhaba, benim adım Rick Pasqua, Virginia Commonwealth Üniversitesi Kimya ve Yaşam Bilimleri Bölümü'ndeki Kök Hücre Mühendisliği Laboratuvarı öğrencisiyim. Bu videoda, laboratuvarımızın, hücre yüzeyi belirteçlerinin nicelleştirilmesi için gözlemlenebilir bir insan pluripotent kök hücre tabakası oluşturmak için ucuz ve kendi kendine yapılan bir STO spin aparatını nasıl kullandığını göstereceğim. Birçok İMMÜNOKİMYASAL protokolün, koloniler olarak oda slaytlarında yetiştirilen h PSC'ler için uyarlandığı göz önüne alındığında, biyobelirteçlerin ekspresyonunun bireysel hücre düzeyinde karakterize edilmesinde sorunlar ortaya çıkabilir.

Hücrelerin tek tabakalı bir tabakada olması, yalnızca bunların görsel analizine değil, aynı zamanda muhtemelen ifadelerinin ölçülmesine de yardımcı olur, laboratuvarlarımızın kullandığı sinüs spin aparatı, çoğu laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak yapılabilir, yalnızca küçük bir hücre örneğine ihtiyaç duyar ve herhangi bir spesifik reaktife ihtiyaç duymaz. Ve daha da önemlisi, gözlem için tek hücrelerin yayılmasını güvenilir bir şekilde yeniden üretebilir. İşte sitozin cihazını oluşturmak için ihtiyaç duyacağınız şeylerden bazıları.

Plastik kaydıraklar, bunların mutlaka temiz olması gerekmediğinden, dilerseniz eski hazneli kaydırakları kullanabilirsiniz. Önceden temizlenmiş cam slaytlar. Bunların temizlenmesi gerekir çünkü burası hücre tek tabakasının oluşturulduğu yer olacaktır.

Filtre kağıdı, her türlü yapmalı ve mikro pipet uçlarını kullanmalısınız. Bir ila 10 mikrolitrelik uçlar, inşaat başlamadan önce laboratuvarımızın kullandığı şeydir. Plastik kızaklara önce delikler açılmalıdır.

Bu bir matkap presi kullanılarak yapılabilir. Deliklerin çapı mikro pipet ucunun boyutuna bağlıdır ve standart bir ila 10 mikro pipet ucu için kullanılan ucun en geniş bölümünün genişliği kadar olmalıdır. Bu yaklaşık yedi milimetre olmalıdır.

Plastik slaytlarda oluşturduğunuz deliklerin miktarı tamamen onun için kullanım amacınıza bağlıdır. Örneğin, laboratuvarımızın immünokimyasal boyaması için, genellikle biri pozitif leke ve diğeri negatif arka plan kontrolü için olmak üzere iki delik kullanırız. Bu slaytlar belirsiz bir süre için yeniden kullanılabilir.

Filtre kağıdı için, plastik sürgünün parametrelerine göre bir parçasını kesmeniz yeterlidir. Filtre kağıdında delik açmak için slaytın deliklerini referans olarak kullanın. Filtre kağıdı üzerindeki deliğin boyutu, mikro pipet ucunun burada gösterildiği gibi tam olarak oturabilmesi için yeterince büyük olmalıdır.

Daha sonra, her delik için yaklaşık yarısı uzunluğunda bir tane olmak üzere uygun sayıda mikro pipet ucunu kesmemiz gerekiyor. Bu, hücresel mono katmanın oluşturulacağı cam sürgünün tabanı olarak işlev görecektir. Daha sonra, filtre kağıdı bunun üzerine konacaktır.

Filtre kağıdı, süspansiyon lekesinden kaynaklanan fazla ortamın herhangi birini emmeye hizmet edecektir. Bu daha sonra aparatların katı desteği olarak işlev görecek plastik sürgü ile tamamlanacaktır. Bu daha sonra normal ev bandı ile dört taraftan da kapatılabilir.

Son olarak, bütün mikropipet uçları daha sonra aparatın kesilen uçlarına yerleştirilir. Bu, süspansiyon boyamasını takiben hücresel örneklerin yerleştirildiği yer olacaktır. Daha rahat tanınması için kesme uçlarının cam sürgünün neresinde olduğunu başlangıçta işaretlemek de yararlı olabilir.

Laboratuvarımızın kullandığı İmmünokimyasal Süspansiyon Boyama protokolü, önce kök hücrelerin tek bir hücre süspansiyonuna toplanmasını içerir, genellikle tripsin veya enzimatik olmayan EDTA bazlı hücre ayrışma tamponları kullanılarak enzimatik olarak yapılır. Hücreler daha sonra bir ml, iki ml'lik mikro santrifüj tüplerine ve standart büyüme ortamlarına aktarılır. Bunlar daha sonra dört dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjlenir.

Aynı santrifüj hızı, sonraki tüm yıkama ve sıkma adımları için kullanılacaktır. Ortam daha sonra manuel olarak aspire edilir, hücre peletinin rahatsız edilmediğinden emin olmak için aspire ederken ekstra dikkatli olun. Bu daha sonra bir ml PBS ile yıkanır, iki kez döndürülür ve her seferinde aspire edilir.

Bir sonraki adım, bunu yapmak için gereken veya bu video için eşlik eden yazıda listelenen% 4 çift formaldehit veya PFA reaktifleri kullanılarak hücrelerin sabitlenmesini içerir. Hücreler% 4'lük çift formaldehit çözeltisi içinde inkübe edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir. Bu adımın, sito spin aparatının kullanımı için boyama olan eski hücre dışı süspansiyondan önce gerçekleştirilmesi önerilir.

Daha sonra, PFA izlerini gidermek için hücreler PBS ile iki kez yıkanır. Daha sonra spesifik olmayan lekelenmeyi önlemek için hücre bloke edilmelidir. Bir önceki adımda PBS yıkamalarından sonra, yıkamayı aspire edin ve bir ml bloke edici solüsyon ekleyin.

Bu daha sonra yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bloke edici çözeltiyi beklerken, primer antikoru önerilen seyreltme ve bloke edici solüsyona seyrelterek hazırlayabilirsiniz. Bunu dört santigrat derecede saklayın.

Hücreler yaklaşık 45 dakika boyunca bloke edici çözelti içinde kaldıktan sonra, aşağı doğru döndürün ve bunu aspire edin ve bunları birincil antikor çözeltisinde tekrar askıya alın. Spesifik olmayan bağlanmayı ve arka plan kontrolünü tespit etmek amacıyla, en az bir numuneyi negatif olarak tutmak en iyisidir. Primer antikor uygulanmadı ve sadece PBS'de resuste süspansiyon edildi.

Tüm numuneler oda sıcaklığında yaklaşık bir saat bekletilir. İstenirse, sabit hücreler gece boyunca primer antikor çözeltisinde süspansiyon halinde bırakılabilir ve bloke edici çözelti ile iki kez yıkanabilir. İkincil antikor çözeltisi yıkama yapılırken yapılabilir.

İkincil antikorlar genellikle ışığa duyarlıdır, bu nedenle mümkünse laboratuvar ışıklarını kısın ve alüminyum folyo ile kullanılan kapları kapatın, bu floresan ağartmayı önlemek için yapılır. Antifa reaktifleri protokole dahil edilebilir, ancak bloke edici çözeltide önerilen konsantrasyona seyreltilmiş birincil antikor gibi daha yüksek bir arka plan ile sonuçlanabileceğinden, kullanımlarında dikkatli olunmalıdır. Yıkama tamamlandıktan sonra birincil eklenip eklenmediğine bakılmaksızın tüm numunelere bir vis uygulayın.

Bunu bir kavanozun içi gibi karanlık bir alanda yaklaşık bir saat bekletin. Hücreleri bir ml bloke edici solüsyonla iki kez yıkayın. Hücre artık DPI boya ile nükleer boyamaya hazır olmalıdır.

DPI çözeltisini başlangıçta PBS'de bir ila 10.000 seyreltmede hazırlayın, hücreleri bir ml PBS'de bir kez yıkayın, sonra tekrar karıştırın, dpi'de askıya alın ve oda sıcaklığında yaklaşık beş ila 10 dakika bekletelim. İkincil antikor gibi, DAPI de ışığa duyarlıdır, bu nedenle floresan ve ağartmayı önlemek için gerekli ayarlamaları yapın. Bir ml PBS ile bir kez yıkayın ve son olarak reus ile yıkayın.

Bir ml PBS'de tekrar askıya alın. Bu daha sonra bir cyto spin aparatı ile kullanıma hazır olmalıdır. Mikro pipet uçlarının üst kısmına optimum'u maksimum 100 mikrolitre tek hücreli solüsyon yerleştirin.

Gereksiz taşma veya damlamayı önlemek için daha düşük bir miktar önerilir. Sonra. Bir cyto spin aparatını ve karşı dengeyi bir masa santrifüjüne yerleştirin ve dört dakika boyunca 1000 RPM'de döndürün. Daha sonra, cyto spin aparatını, hücrelerin cam slayttan çıkma olasılığını en aza indirecek şekilde dikkatlice sökün.

Montajdan önce floresan mikroskobu altında ayakta durmanın gerçekleştiğini doğrulayın. Bunlar, sito spin aparatından SSCA dört hücre yüzey belirteçleri ile boyanmış bir tek tabaka BG bir V hücresinin çekilmiş resimleridir. Hücrelerin birbirinden ne kadar izole edildiğine dikkat edin, bu da tek hücre gözlemlerini ve kaydı mümkün kılar.

Bu protokolün iyi yanı, kök hücre kültürlerinin herhangi bir rutin analizi için uygulanabilir, uygun maliyetli ve kolayca uyarlanabilir tek katmanlı hücreleri çoğaltabilmesidir. Bununla birlikte, umarım bu videoyu çizersiniz ve kendi araştırmanızda kullanım protokolünü bulursunuz.