Name: Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, kendi yapımı sitospin aparatı kullanarak insan pluripotent kök hücreler için immünositokimyasal analiz yöntemini. Bu teknik, hücre yüzey belirteçlerinin güvenilir gözlemi ve niceliksel analizi için maliyet etkin bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NSF KARİYER 0744556 (Rao) ve VCU HHMI Bilim Eğitim ve Araştırma Programı (Pascual) aracılığıyla burs tarafından bu iş için kısmi finansman sağlandı.

Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama <ol><li> Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir. </li><li> Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj. </li><li> Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya - (Mg 2 olmadan + ve Ca 2 +) ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır. </li><li> Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya onlara 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 ml% 4 paraformaldehid (PFA) tarafından sabitlenir. </li><li> Hücreler iki kez 1ml PBS tekrar yıkanır. </li><li> Yıkama, blok hücreleri sonra yeniden askıya Blok Çözüm 1 ml (% 6 serum/94% PBS). 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 200 gr az 4 dakika sonra, tüpler santrifüj ve Blok Çözüm aspirat. Primer antikor çözeltisi (Blok Çözüm tavsiye seyreltme ile yapılan) 1ml hücreleri yeniden askıya. Hücreler ya 1 saat veya 4 ° C&#39;de bir gece bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında inkübe edilebilir. </li><li> Hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez yıkanır. </li><li> Sekonder antikoru çözümü (tavsiye edilen seyreltme Blok Çözüm ile yapılan) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe 1mL hücreleri yeniden askıya sonra. </li><li> 1 saat sonra, hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez tekrar yıkanmış olmalıdır. </li><li> Blok Çözüm ile yıkadıktan sonra, 1 ml PBS ile tekrar hücreleri yıkayın. </li><li> Çeşitli yıkar sonra, 1 ml hücrelerin yeniden askıya DAPI nükleer leke (PBS içinde DAPI 1:10,000 seyreltme -) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 dakika sonra, 4 dakika için 200 gr tüpler santrifüj. - 1 ml PBS DAPI nükleer leke çözüm ve yeniden askıya hücreleri aspire. </li></ol> HPSCs Incorporation Bölüm 2: sitospin aparatı sayesinde üretilen slaytlar <ol><li> Plastik slaytlar, bir matkap basın delik istenilen miktarda yaparak hazırlanıyor. Kullanılmak üzere geniş çaplı mikropipet ucu (ler) den en fazla 1 mm daha geniş çaplı olması gerekir. </li><li> Filtre kağıdı, makas ile plastik slayt parametreleri kesilir. </li><li> Delik sonra filtre kağıdı yapılır. Deliğin boyutu (ler) mikropipet ucu (ler) aracılığıyla snuggly oturduğundan emin yeterince büyük olmalıdır. </li><li> Sonra, hazırlanan plastik slaytlar bir üst ve alt kesilmiş filtre kağıdı (Şekil 1) yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Katmanları bant ile sabitlenir. </li><li> Bölüm 1 lekeli hücre süspansiyonu 100μL maksimum (istenilen tek tabaka yoğunluğuna bağlı olarak) daha sonra mikropipet ucu (lar) üstüne yerleştirilir. </li><li> Gerekirse, cihazı hücre çözümü ile tartılır ve benzer ağırlıkta bir karşı denge oluşturulmuş. </li><li> Sitospin aparatı ve dengelemek sonra bir masaüstü santrifüj yerleştirilir ve 200g 4 dakika santrifüj yapabilirsiniz. </li><li> Santrifüj sonra, sitospin aparat dikkatle cam slayt hücreler yerinden doesnt bir şekilde demonte. </li><li> Gerekirse, aşırı çevreleyen PBS - cam tarafında aspire. </li><li> Hücreler daha sonra istediğiniz hücreye tek tabaka elde edilip edilmediğini kontrol etmek için bir floresan mikroskop kullanılarak görülebilir. </li></ol> Bölüm 3: Montaj slaytlar <ol><li> Bir damla istenen montaj medya hücreleri içeren her bölgenin merkezinde yer almaktadır. </li><li> Sonra, mümkünse hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz Slaytlarınıza bir kapak kayma yavaşça indirilir. </li><li> Aşırı montaj medya sonra slayt kaldırılır. </li><li> Sonra, kapak fişleri iki tırnak cilası ile mühürlenir. </li><li> Slaytlar sonuçları gözlemlenen ve belgelenen kadar karanlık bir depolama alanı saklanabilir. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşulları kök hücre kültürleri büyüyen kull...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Yeniden kullanılan plastik lamlar için materyal</td></tr><tr><td>Önceden Temizlenmiş Superfrost/Plus Mikroskop Lamları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10&amp;mu;L Filtreli Pipet Uçları</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Lamel Camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Kapatma Ortamı</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoklonal Antikor</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>SSEA-4 boyaması için primer antikor</td></tr><tr><td>Rat Anti-SSEA-3 Monoklonal Antikor</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>SSEA-3 boyaması için primer antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>SSEA-4 boyaması için sekonder antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Etiketli Keçi Anti-Rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>SSEA-3 boyaması için sekonder antikor</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochloride</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

self-made sitospin aparatı kullanarak İnsan pluripotent kök hücre İmmünositokimyasal analizi

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer<em&gt; In vitro</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em&gt; Birden çok hücre tiplerine farklılaşma stratejileri. Bunlar arasında, immünositokimyasal teknikleri aday hücre içi ve hücre yüzeyi biyobelirteçleri analizine dayalı hPSCs farklılaşmamış devletin rutin karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Koloniler, sorunları rutin olarak tek tek hücre düzeyinde bu belirteçlerin ifade nicel olarak ortaya çıkan hPSCs büyüdüğünü göz önüne alındığında. Flow sitometri analizleri, bu sorunu ancak hücre sayıları ve normal, hPSC kültürlerin rutin kalite kontrol değerlendirmesi için elverişli değildir reaktifler kullanımı için hizmet vermektedir. Böylece, belirteç değerlendirilmesi için bütünlüğü korunmuş tek tabaka hücre örnekleri oluşturmak pratik ve tekrarlanabilir araçlarının geliştirilmesi, kök hücre araştırmaları pek çok avantajı vardır. Tek tek hücrelerin tek tabaka kolayca gözlenir ve spesifik belirteçler ifade için nicel olabilir, çünkü bu, immünositokimyasal analiz büyük ölçüde yarar sağlar. Bu hedefe doğru, self-made sitospin aparat inşa edildi ve immünositokimyasal boyama ile kullanım için optimize edilmiş. İki hücre yüzey belirteçleri (SSEA3/SSEA4) ifadesi için bir varyantı BG01 Bu protokolün amacı, kök hücre hattı analiz edildi.

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

İnsan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) ve insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini (hiPSC'ler) içeren insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), heyecan verici hücre...

Merhaba, ben Rick Pasqua, Virginia Commonwealth Üniversitesi Kimya ve Yaşam Bilimleri Bölümü'ndeki Kök Hücre Mühendisliği Laboratuvarı'nda öğrenciyim. Bu videoda, laboratuvarımızın hücre yüzey markerlarının kantifikasyonu için gözlemlenebilir bir insan pluripotent kök hücre monokatmanı oluşturmak amacıyla düşük maliyetli ve kendi yapımımız olan bir STO spin aparatını nasıl kullandığını göstereceğim. Birçok İMMÜNOKİMYASAL protokolün oda slaytlarında koloni şeklinde büyütülen hPSC'ler için uyarlanmış olduğu göz önüne alındığında, biyomarker ekspresyonunun tek hücre düzeyinde karakterize edilmesinde sorunlar ortaya çıkabilmektedir.Hücrelerin tek tabaka halinde olması, yalnızca bunların görsel analizine yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda muhtemelen ekspresyonlarının miktar tayinine de katkı sağlar; laboratuvarlarımızın kullandığı sinus spin aparatı, çoğu laboratuvarda bulunan malzemelerle oluşturulabilir, yalnızca küçük bir hücre örneği gerektirir ve herhangi bir özel reaktif kullanımına ihtiyaç duymaz. Daha da önemlisi, gözlem için tekil hücrelerin yayılımını güvenilir bir şekilde yeniden üretme kapasitesine sahiptir. İşte sitozin aparatını kurmak için ihtiyaç duyacağınız bazı malz

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İmmünositokimya varlığı, hücre içi lokalizasyonu ve kültür hücreleri ilgi antijen göreceli bolluk belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol sunan, kolay takip serisi bir antikorlar korunması ve boyama en iyi şekilde almak için sağlayacak adımlar.

İmmünositokimya: İnsan Sinir Kök Hücreler

Pluripotent kök hücreleri süspansiyon büyüyen embriyoid organları (EBS) farklılaşırlar. Agrega olarak organizasyon korurken, embriyogenez hücresel ve moleküler yönlerini çalışmak için yararlıdır, yüksek kaliteli EB cryosections elde etmek için nasıl göstermek.

Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu protokol, ek eksojen takviye veya hPSC'ye özgü sentetik substrat olmaksızın jelatin kaplı bir tabakta yalnızca insan plasentasından türetilen şartlandırılmış ortamı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) çoğaltmak için basit ve etkili bir yol sağlar.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Öğrenin, kendi yapımı sitospin aparatı kullanarak insan pluripotent kök hücreler için immünositokimyasal analiz yöntemini. Bu teknik, hücre yüzey belirteçlerinin güvenilir gözlemi ve niceliksel analizi için maliyet etkin bir çözüm sunar.

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Daha fazla video keşfet