Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Merhaba, ben Rick Pasqua, Virginia Commonwealth Üniversitesi Kimya ve Yaşam Bilimleri Bölümü'ndeki Kök Hücre Mühendisliği Laboratuvarı'nda öğrenciyim. Bu videoda, laboratuvarımızın hücre yüzey markerlarının kantifikasyonu için gözlemlenebilir bir insan pluripotent kök hücre monokatmanı oluşturmak amacıyla düşük maliyetli ve kendi yapımımız olan bir STO spin aparatını nasıl kullandığını göstereceğim. Birçok İMMÜNOKİMYASAL protokolün oda slaytlarında koloni şeklinde büyütülen hPSC'ler için uyarlanmış olduğu göz önüne alındığında, biyomarker ekspresyonunun tek hücre düzeyinde karakterize edilmesinde sorunlar ortaya çıkabilmektedir.

Hücrelerin tek tabaka halinde olması, yalnızca bunların görsel analizine yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda muhtemelen ekspresyonlarının miktar tayinine de katkı sağlar; laboratuvarlarımızın kullandığı sinus spin aparatı, çoğu laboratuvarda bulunan malzemelerle oluşturulabilir, yalnızca küçük bir hücre örneği gerektirir ve herhangi bir özel reaktif kullanımına ihtiyaç duymaz. Daha da önemlisi, gözlem için tekil hücrelerin yayılımını güvenilir bir şekilde yeniden üretme kapasitesine sahiptir. İşte sitozin aparatını kurmak için ihtiyaç duyacağınız bazı malzemeler.

Plastik lamlar, bunların mutlaka temiz olması gerekmediği için dilerseniz eski chamber lamları kullanabilirsiniz. Önceden temizlenmiş cam lamlar. Hücre monokatmanının oluşturulacağı yer burası olduğu için bunların temizlenmesi gerekir.

Herhangi bir türü uygun olan filtre kağıdı ve mikropipet uçları. Laboratuvarımızda kurulum başlayabilmesi için 1 ila 10 µL uçlar kullanılmaktadır. Öncelikle plastik lamlar üzerinde delikler açılmalıdır.

Bu işlem bir sütunlu matkap kullanılarak yapılabilir. Deliklerin çapı, mikro pipet ucunun boyutuna bağlıdır ve standart bir 1-10 µL mikro pipet ucu için ucun en geniş bölümünün genişliğinde olmalıdır. Bu değer yaklaşık yedi milimetre civarında olmalıdır.

Plastik slaytlarda açacağınız delik sayısı tamamen kullanım amacınıza bağlıdır. Örneğin, laboratuvarımızın immünokimyasal boyama işlemleri için genellikle biri pozitif boyama, diğeri ise negatif arka plan kontrolü için olmak üzere iki delik kullanıyoruz. Bu slaytlar belirsiz sayıda kez yeniden kullanılabilir.

Filtre kağıdı için, kağıttan plastik lamın parametrelerine uygun bir parça kesin. Filtre kağıdı üzerinde delikler açmak için lamın üzerindeki delikleri referans olarak kullanın. Filtre kağıdındaki deliğin boyutu, burada gösterildiği gibi mikropipet ucunun tam oturabileceği kadar büyük olmalıdır.

Ardından, her bir delik için yaklaşık olarak boyunun yarısı kadar, uygun sayıda mikro pipet ucu kesmemiz gerekir. Bunlar, hücresel monokatmanın oluşturulacağı cam lamın tabanı görevini görecektir. Sonrasında, bunun üzerine filtre kağıdı yerleştirilecektir.

Filtre kağıdı, süspansiyon boyamasından kaynaklanan fazla besiyerini absorbe etmeye yarayacaktır. Bunun üzerine, aparatın katı desteği görevini görecek olan plastik lam yerleştirilecektir. Daha sonra tüm dört kenar, standart ev tipi bant ile kapatılabilir.

Son olarak, mikropipet uçları bütün halde aparatın kesilmiş uçlarına yerleştirilir. Süspansiyon boyaması sonrası hücresel örnekler buraya konulacaktır. Daha kolay tanınabilmesi için, kesilmiş uçların lam üzerindeki konumlarının başlangıçta işaretlenmesi faydalı olabilir.

Laboratuvarımızın kullandığı İmmünokimyasal Süspansiyon Boyama protokolü, öncelikle kök hücrelerin tek hücreli bir süspansiyon halinde toplanmasını içerir; bu işlem genellikle tripsin kullanılarak enzimatik sindirimle veya enzimatik olmayan EDTA tabanlı hücre ayrıştırma tamponları kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra 1 ml veya 2 ml'lik mikro santrifüj tüplerine ve standart büyüme ortamlarına aktarılır. Bunlar daha sonra 200 ×g'de dört dakika boyunca santrifüj edilir.

Sonraki tüm yıkama ve çöktürme basamaklarında aynı santrifüj hızı kullanılacaktır. Ardından ortam manuel olarak aspire edilir; hücre peletinin yerinden oynamadığından emin olmak için aspirasyon sırasında ekstra dikkatli olunmalıdır. Daha sonra, her seferinde çöktürme ve aspirasyon yapılarak 1 ml PBS ile iki kez yıkanır.

Bir sonraki adım, hücrelerin %4'lük formaldehit veya PFA kullanılarak fikse edilmesini içerir; bunları hazırlamak için gereken reaktifler videoya eşlik eden yazıda listelenmiştir. Hücreler %4'lük formaldehit çözeltisi içinde inkübe edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. Bu adımın, ekstraselüler süspansiyon ve sitospin cihazı kullanımı için yapılan boyama işlemlerinden önce gerçekleştirilmesi önerilir.

Ardından, PFA kalıntılarını temizlemek için hücreler iki kez PBS ile yıkanır. Spesifik olmayan boyanmayı önlemek için hücreler daha sonra bloke edilmelidir. Önceki adımdaki PBS yıkamalarının ardından, yıkama solüsyonunu aspire edin ve bir ml bloklama solüsyonu ekleyin.

Bu karışım ardından yaklaşık 45 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmelidir. Bloklama çözeltisinin bekleme süresi boyunca, primer antikoru önerilen seyreltime ve bloklama çözeltisine göre seyrelterek hazırlayabilirsiniz. Bunu 4 °C'de saklayın.

Hücreler bloklama solüsyonunda yaklaşık 45 dakika bekletildikten sonra, santrifüjle çöktürün, sıvıyı aspire ederek uzaklaştırın ve hücreleri primer antikor solüsyonunda yeniden süspande edin. Spesifik olmayan bağlanmayı ve arka plan kontrolünü tespit etmek amacıyla, en az bir örneği negatif kontrol olarak tutmak en iyisidir. Bu örnekte primer antikor uygulanmaz ve hücreler sadece PBS içinde yeniden süspande edilir.

Tüm örnekler yaklaşık bir saat boyunca oda sıcaklığında bekletilir. Arzu edilirse, fikse edilmiş hücreler birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca süspansiyon halinde bırakılabilir ve ardından bloklama çözeltisi ile iki kez yıkanabilir. Yıkama işlemi sırasında ikincil antikor çözeltisi hazırlanabilir.

Sekonder antikorlar genellikle ışığa duyarlıdır, bu nedenle mümkünse laboratuvar ışıkları kısılmalı ve kullanılan tüm kaplar alüminyum folyo ile kapatılmalıdır; bu işlem floresans solmasını önlemek için yapılır. Antifa reaktifleri protokole dahil edilebilir, ancak bloklama solüsyonunda önerilen konsantrasyonda seyreltilmiş primer antikor gibi daha yüksek bir arka plan oluşumuna neden olabileceği için kullanımlarında dikkatli olunmalıdır. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, primer antikor eklenmiş olsun veya olmasın, tüm örneklere bir vis uygulayın.

Bunu bir kavanozun içi gibi karanlık bir alanda yaklaşık bir saat boyunca bekletin. Hücreleri bir ml bloklama solüsyonu ile iki kez yıkayın. Hücre artık DPI boyası ile nükleer boyamaya hazır olmalıdır.

DPI çözeltisini başlangıçta PBS içerisinde 1/10.000 oranında seyrelterek hazırlayın, hücreleri bir kez 1 ml PBS ile yıkayın, ardından yeniden süspande edin, DPI içerisinde askıya alın ve oda sıcaklığında yaklaşık 5 ila 10 dakika bekletin. Sekonder antikor gibi, DAPI de ışığa duyarlıdır, bu nedenle floresan ağarmasını önlemek için gerekli düzenlemeleri yapın. Bir kez 1 ml PBS ile yıkayın ve son olarak yeniden süspande edin.

Tekrar 1 ml PBS içinde süspanse edin. Bu işlemden sonra örnek, sitospin cihazı ile kullanıma hazır hale gelmelidir. Tek hücreli solüsyondan en fazla 100 µl miktarında örneği mikro pipet uçlarının üst kısmına yerleştirin.

Gereksiz taşmaları veya damlamaları önlemek için daha düşük bir miktar önerilir. Ardından, bir cyto spin aparatı ve karşı ağırlığı masaüstü santrifüje yerleştirin ve 1000 RPM'de dört dakika boyunca döndürün. Sonrasında, hücrelerin lamdan yerinden çıkma olasılığını en aza indirecek şekilde cyto spin aparatını dikkatlice sökün.

Montajdan önce, floresan mikroskobu altında hücrelerin dikleştiğini (standing) doğrulayın. Bunlar, cyto spin cihazı kullanılarak SSCA dört hücre yüzey belirteçleri ile boyanmış bir BG one V hücre monotabakasından alınmış fotoğraflardır. Hücrelerin birbirinden ne kadar izole olduğuna dikkat edin; bu durum, tek hücre gözlemlerini ve kayıtlarını mümkün kılmaktadır.

Bu protokolün avantajı; uygulanabilir, maliyet etkin ve kök hücre kültürlerinin her türlü rutin analizi için kolayca uyarlanabilir bir hücre monolayer tabakası oluşturabilmesidir. Bu doğrultuda, bu videodan faydalanmanızı ve protokolü kendi araştırmalarınızda kullanmanızı dilerim.