Kronik Salmonella Infected Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, kronik salmonella ile enfekte olmuş bir fare modeli oluşturmaktır. Bu, önce bir salmonella çözeltisi hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, fareleri streptomisin ile gavajlamak, ardından salmonella veya sadece streptomisin ile takip etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, salmonella'yı fare dışkı maddesinden izole etmek ve BL kroma plakaları kullanarak fare bağırsağındaki salmonella enfeksiyonunu tespit etmektir. Prosedürün son adımı, fare vücut kütlesini gözlemlemek ve kaydetmek ve salmonella enfeksiyonunu takiben canlılıktaki değişiklikleri not etmektir. Sonuç olarak, farelerin bağırsağında salmonella ile gavaj yapabileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Tıp Bölümü'nde Dr.Johnson'ın laboratuvarından Michelle P. Ben de Sun Lab'dan ve Sun Lab'den Y'yim. Bugün size Alytic Lennar enfekte kitle modeli oluşturmak için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü doğumumuzda konakçı bakteri etkileşimini, sinyal iletimini ve tümör oluşumunu incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneyden önce, her bir salmonella suşu için ve deney boyunca kullanmak üzere yeterli miktarda luria, berti veya LB suyu plakası hazırlayın.

Plakalar buzdolabında saklanabilir ve birkaç ay saklanabilir. Sonra, salmonella kültürü hazırlayın. Eksi 80 santigrat derecede donmuş bir şişe stok salmonella'yı çıkarın ve salmonella alevi kaplamak için tezgahın üzerinde çözülmesine izin verin.

Bir çörek ve brülörde bir aşılama halkası ve çözülmüş bakteri stoğuna daldırın. LB plakasının üst üçte birlik kısmında ilmeği ileri geri zikzak çizin. Halkayı tekrar alevlendirin ve plakayı döndürün.

Önceki çizgileri geçmek ve bakterileri plakanın ikinci üçte birlik kısmına yaymak için halkayı zikzak çizin. Bir kez daha tekrarlayın. Döngüyü tekrar alevlendirmek.

İlmeğin agarın içine girmesine izin vermeyin. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde saklayarak kolonilerin büyümesine izin verin. Doğru yapılırsa, salmonella plakası en az bir bölümde ayrı koloniler vermelidir.

Ertesi gün. Steril bir kürdan veya bakteri halkası kullanarak LB plakasından bir klon seçin ve 12 mililitrelik bir tüpte yedi mililitre LB'ye koyun. Tüpü yaklaşık beş saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayın.

Aşılamak için bu kültürün 0.05 mililitresini kullanın. Bir Falcon tüpünde 50 mililitre LB. Yaklaşık 18 saat çalkalamadan 37 santigrat derecede inkübe edin.

50 mililitre bakteri gece kültürünü oda sıcaklığında 5.000 RPM'de 10 dakika döndürün ve süpernatanı atın. Daha sonra, bakterileri yeniden süspanse etmek için tüpe 1.5 mililitre Hank'in tamponlu tuz çözeltisi veya HBSS veya 100 kısım lb ila üç kısım HBSS ekleyin. Daha sonra HBSS ile toplam hacmi 15 mililitreye veya bir ila 10 LB / HBSS oranına getirin.

Her fare, deneyden dört saat önce farelerden gavaj çekme suyu ve yiyeceğe başlamadan önce 100 mikrolitre seyreltilmiş salmonella kültürü veya bir kez 10 ila altı ila bir kez 10 ila sekiz koloni oluşturan birim gerektirir. Daha sonra, 100 mikrolitre HBSS'de 7.5 miligram toz streptomisin seyrelterek gavajdan hemen önce bir streptomisin çözeltisi hazırlayın. Enjekte edilen her fare için, fare gavajından önce kaybı hesaba katmak için fazladan bir hacim hazırladığınızdan emin olun.

İlk olarak, 100 mikrolitre streptomisin çözeltisi içeren bir besleme iğnesi hazırlayın. Gavaj almak için ilk fareyi kafesten çıkarın ve fareyi tezgah üstüne doğru bakacak şekilde tutun. Yemek borusunu düz hale getirmek için işaret parmağınızla baş ve boynu gererek, başparmağınız ve orta parmağınızla farenin omzunun üzerinden cildi sıkıca tutun.

Besleme iğnesinin bilyeli ucunu ağzın çatısı boyunca ve farenksin arkasının sağ tarafına doğru yönlendirin. Sonra yavaşça yemek borusuna geçirin ve 100 mikrolitre streptomisin solüsyonunu enjekte edin. Herhangi bir direnç hissedilmemelidir.

Deney yapılan tüm fareler için bu işlemi tekrarlayın deney ve kontrol. Strp de m ve gavajdan yaklaşık 20 saat sonra ve salmonella gavajından dört saat sonra, ağızdan salmonella gavajı alacak farelerden su ve yiyecek çekin. HBSS'de 100 mikrolitre salmonella çözeltisi kullanarak her fareyi daha önce olduğu gibi gavajlayın.

Gavajdan sonra, dışkı toplamaya başlamak için her fareyi yeni bir kafese aktarın. Gavajdan yaklaşık sekiz saat sonra başlayarak, dışkı maddesini düşürdükten hemen sonra kafesten çıkarın. Deneysel örnek olarak 100 miligram fare dışkı maddesi toplayın.

Dışkı maddesi salmonella analizi için çalışma uzunluğuna bağlı olarak günlük veya haftalık numune toplayın. Dışkı örneğini bir mililitre PBS ile 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 800 RPM'de 10 dakika boyunca kuvvetlice santrifüjleyin. Süpernatanı beş dakika boyunca 6.000 RPM'de temiz bir 1.5 mililitrelik tüp santrifüjüne aktarın.

Süpernatanı atın ve yeniden askıya almak için pelet girdabına 200 mikrolitre PBS ekleyin. Ardından, bir BB l roag plakası ile salmonella'yı tespit edin. İkinci bölümde gösterildiği gibi plakaya yayılan plaka başına 10 ila 100 mikrolitre dışkı maddesi çözeltisi kullanın.

Salmonella türleri, seçilen kromojenlerin varlığındaki metabolik farklılıklar nedeniyle koyu renkli görünür. Tek tek fareler arasındaki enfeksiyon seviyesini karşılaştırmak için plakadaki salmonella kolonilerini sayın. Bu deneysel prosedürde, altı ila yedi haftalık spesifik patojen içermeyen dişi C 57 siyah altı fare kullandık.

Fareler salmonella ve streptomisin artı HBSS ile enfekte edildi. Fareler streptomisin ile gavaj kontrol edildi, sadece kullanılan salmonella suşları arasında salmonella typhimurium vahşi tip suşu, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, patojenik olmayan salmonella mutant suşu ve Dr.James Madera'nın laboratuvarından PSKW 29'da virülansla ilişkili AAV R yaş genini taşıyan üç FPC suşu, düşük kopya plazmid. Bu protokol kullanılarak, fare bağırsağında salmonella tyrian kolonizasyonu tespit edilebilir.

Kronik salmonella enfeksiyonu dışkı analizi ile ölçüldü ve immünofloresan boyama için vücut ağırlığı ve bağırsak dokusu örnekleri alındı. Tipik olarak vücut ağırlığı kaybı ve ölüm, enfeksiyondan sonraki dört hafta içinde ortaya çıkar. Enfeksiyondan dört hafta sonra hayatta kalma oranları burada gösterilmektedir.

Fareler enfeksiyondan dört hafta sonra hayatta kaldığında, fareler vücut ağırlığını kazanır ve kalan 23 haftada ölüm olayları azalır. Genel olarak, salmonella suşları, FSY fsy, A VRA null veya fsy ile enfekte olmuş farelerin% 65'inden fazlası. Bir VRA heterozigotu, bağırsakta kalıcı salmonella enfeksiyonu ile altı aydan fazla hayatta kalabilir.

Akut enfeksiyondan sonra, hayatta kalanlar hala salmonella taşıyorlardı ve bu protokolde açıklanan yöntem kullanılarak enfeksiyondan altı ay sonra tespit edilebiliyordu. Fare bağırsağından alınan doku örneklerinin immünofloresan analizi, enfeksiyondan 27 hafta sonra bağırsak mukozasında salmonella istilasını göstermektedir. Bu görüntüde, çekirdekler maviye boyanmıştır ve enfekte olmuş salmonella yeşil renkle gösterilmiştir.

Kontrol grubunda gösterildiği gibi, salmonella kolonizasyonu olmadığını gösteren parlak yeşil lekelenme yoktur. Salmonella ile enfekte farelerde enfeksiyondan 27 hafta sonra ise, bağırsak mukozasında parlak yeşil lekelenme vardır. Bu, streptomisin ön işlem görmüş farede salmonella enfeksiyonunun kalıcılığını gösterir.

Fare modelinde bazılarının kronik enfeksiyonunu nasıl indükleyeceğinizi size gösterdik. Bu prosedürü uygularken, deney modelinizin çalıştığından emin olmak için garaj için biraz kültür hazırlamayı, garaj becerilerini düzeltmeyi ve ANA'nın varlığını tespit etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.