Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Çiçek daldırma, arabidopsis bitkilerini bir muhabir yapısıyla dönüştürmek için kullanılır. Elde edilen transgenik bitkiler daha sonra raportör genin ekspresyonu için incelenir. İlk olarak genç çiçekli arabidopsis bitkileri, raportör yapısını içeren Efeslilere bir agrobacterium çözeltisine batırılır.

Daha sonra, bitkiler, küçük bir yüzdesi yabancı gen ile dönüştürülecek olan tohumlar üretene kadar normal büyüme koşullarına geri döndürülür. İşlemin üçüncü adımı, bitkilerden tohumların toplanması ve antibiyotik içeren seçim ortamına ekilmesidir. Son olarak antibiyotikli selektif besiyeri üzerinde büyüyen fideler incelenir.

Yabancı geni içeren transgenik fideler antibiyotiklere dirençlidir ve canlı kalırken, transgenik olmayan fideler sonunda beyazlaşır ve ölür. Transgenik fidelerde raportör gen ekspresyonu, transgenik fidelerin raportör genin substratı ile boyanması ve hücrelerin ve dokuların diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenmesiyle gözlemlenir. Merhaba, ben Maryland Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nden Dr.Zou'nun laboratuvarından Chloe Mara.

Ben de Dr.Z Chile'nin laboratuvarından Wna gva. Bugün size arabidopsis bitkilerini dönüştürmek için çiçek derinliği yöntemini göstereceğiz. Daha sonra size transgenik bitkilerde rapor edilen gen ekspresyonunu nasıl inceleyeceğinizi göstereceğiz.

Laboratuvarımız, gen ekspresyonunu ve işleyen bitkileri incelemek için bu prosedürleri rutin olarak kullanır. Öyleyse başlayalım. Bu yordama dönüşümden yaklaşık bir ay önce başlayın.

Saksı başına yaklaşık 10 ila 15 bitki olacak şekilde dört ila sekiz beş inçlik kare saksıya bir tavşan tohumu ekin ve ardından tohumları yerleştirmeden önce üç gün boyunca soğuk bir odada dört derecelik tohuma yerleştirin. Verimliliği azaltılmış mutant arabidopsis bitkilerini dönüştürmek için bitki büyüme odaları. Altı ila 10 tencere daha ekleyerek pot sayısını artırın.

Bitkileri standart koşullar altında büyütün. Daha kısa bir gün veya daha düşük sıcaklık rejimi altında yetiştirilen bitkilerin çiçek açması daha uzun sürer ve dönüşüme hazır olması daha uzun sürer. İyi bitki bakımı, başarılı bir dönüşüm için gerekli olan sağlıklı bitkileri sağlar.

Büyüyen bitkilere pestisit püskürtülmesi, bitkiler yeni cıvatalanıp çiçek açmaya başladığında önerilir. Dönüşüm verimliliğini artırmak için dönüşüme hazırlar. Dönüşümden üç ila dört gün önce, floresan sürgünlerinde, cıvatalanır cıvatalanmaz ana kısmı kesin.

Dönüşümden iki gün önce daha fazla ikincil sürgün oluşumunu teşvik etmek için, mil başına 50 mikrogram içeren 40 mililitre LB aşılayın. PT'leri oh iki Gus yapısını içeren agrobakteri Tema Fasion suşu GV 3 1 0 1 ile Canin, 20 ila 30 santigrat derecede çalkalama inkübatörde gece boyunca büyür. Gus, aynı zamanda misin direnci de taşıyan PIN 20 vektörüne klonlanır.

TSO iki promotör, hücre döngüsünü tahrik eder, ertesi gün, yani dönüşümden önceki gün Gus'ın ekspresyonunu düzenler. Gece boyunca kültürün sekiz mililitresini, mililitre başına 50 mikrogram içeren 400 mililitre LB'ye aktarın. CIN, aynı gün 28 ila 30 santigrat derecede titrek bir inkübatörde gece boyunca büyür.

Ayrıca bitkileri sulayın. Bu, toprağın çok fazla ıslanmamasını sağlar. Dönüşüm gününde çiçek daldırma sırasında sızma ortamı, bakterilerin 600 nanometrede emilimini takip etti.

Agrobakteri kültürünün OD 600'ü yaklaşık 0.8'e ulaştığında, agrobakteri gece kültürünü sekiz dakika boyunca döndürün. Dört santigrat derecede 5.000 RPM'de Yeniden Askıya Alın, bir litre taze yapılmış infiltrasyon ortamındaki agrobacterium peleti. Ortamın otoklav olmasına gerek yoktur.

Bir litre agrobakteri içeren infiltrasyon ortamını sekiz inç x 15 inç x iki inç pyx cam tabağa dökün. Bu yüzden bitkileri sızma solüsyonuna daldırmak üzereyiz. Bunu yaparken.

Tencerenin toprağını sızma solüsyonuna batırmamak için özellikle dikkat edin. Artık bakteriler hazır olduğuna göre, saksıyı ters çevirin ve bitkilerin tüm hava kısımlarını sızma filtrasyon solüsyonuna daldırın. Beş dakika basılı tutun.

Bitkinin tüm hava kısımları sızma ortamına daldırılırken her seferinde bir tencereye daldırın. Toprakta daha sonra mantar büyümesi olasılığını azaltmak için toprağın sızma ortamlarından herhangi birini emmesine izin vermekten kaçının. Daldırdıktan sonra, batırdığınız tüm tencereleri bir tepsiye birkaç kat kağıt havlu üzerine yan yatırın.

Kağıt havlular fazla miktarda sızma ortamını emer. Yüksek nem sağlamak için tepsiyi streç filmle örtün. Tepsiyi ertesi gün bitki büyütme odasına yerleştirin.

Kağıt havludaki streç filmi çıkarın ve tencereleri dik olarak yerleştirin. Bu bitkileri daha sonra dört ila beş gün daha sulamayın. Bitkileri yaklaşık üç hafta sonra tohum koyana kadar normal şekilde koruyun ve tohumları toplu halde toplayın.

Transgenik tohumları seçmeye devam edin. İlk olarak, mililitre başına 50 mikrogram içeren Ms.Medium ile plakaları yerleştirin. Misin daha sonra tohum miktarını tartabilir ve tahmin edebilir mi?

0.1 gram tohumun yaklaşık 5.000 tohuma eşit olduğunu bilerek, antibiyotiğe dirençli transgenik bitkileri seçmek için en az 20.000 tohumun taranması gerekir. Daha sonra, tohumları 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde 30 saniye boyunca% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin. Daha sonra tohumları steril suyla yıkayın.

Bir kez tohumları 30 saniye bekletin, mağazadan satın alınan% 10 ağartıcı içeren bir çözelti içinde 5 saniye bekletin. Ve son olarak, tohumları üç ila altı kez steril suyla durulayın. Tohumları sterilize ettikten sonra steril kaputta çalışın ve her MS plakasına yaklaşık 5.000 tohum pipetleyin.

Mililitre başına 50 miligram içerir. Misin, tohumları plaka üzerine eşit şekilde yayabilir ve kontaminasyonu önlemek için plakaları mikro gözenekli 3M bantla kapatabilir mi? Plakaları karanlıkta üç ila dört gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve plakaları bitki büyüme odasına aktarın.

Yaklaşık 14 gün sonra transgenik fideler yeşil kalır. Daha büyüktürler ve soluk yeşile dönen, büyümeyi durduran ve sonunda ölen transgenik olmayan fidelerle karşılaştırıldığında, cos'a ek olarak gerçek yapraklar geliştirirler. Dönüşüm verimliliği ortalama olarak yaklaşık %0,1 ila 0,2 olmalıdır.

Yabani tip bitkilerin dört saksısını dönüştürerek yaklaşık 100 transgenik hat elde edilebilir. Transgenik bitkileri tanımlayın ve köklerini yavaşça ortamdan çekin. Tek tek fideleri toprağa aktarın, bir ila iki gün plastikle örtün.

Ardından kapağı çıkarın. Transgenik fideleri hasat ettikten sonra bitkilerin büyümesine izin verin. Bunları cam sintilasyon şişelerine veya soğuk% 90 aseton içeren einor tüplerine yerleştirin.

Numuneleri buz polistiren üzerinde tutmak, ancak polipropilen üzerinde tutmamak. Mikrotitre plakaları, çok sayıda numuneyi analiz etmek için de kullanılabilir. Tüm numuneler toplandıktan sonra, şişeleri 20 dakika oda sıcaklığında bekletin.

Bu süre zarfında, xgl olmadan taze boyama tamponu oluşturun ve buzun üzerine yerleştirin. Ayrıca, 100 milimolar xgl stok çözeltisini iki milimolar xcl'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek xgl içeren boyama tamponu hazırlayın. 20 dakikalık inkübasyonun sonunda, asetonu numunelerden çıkarın ve boyama tamponunu xgl olmadan ekleyin.

Daha sonra xgl içermeyen boyama tamponunu numunelerden çıkarın ve xgl içeren boyama tamponunu numunelere ekleyin. Numuneleri 15 ila 20 dakika boyunca vakum altında sızmaya devam edin. Vakumu yavaşça serbest bırakın ve tüm numunelerin boyama solüsyonunun yüzeyinin altına battığını doğrulayın.

Gerekirse, tüm numuneler yüzeyin altına batana kadar sızmayı tekrarlayın. Vakum serbest bırakıldıktan sonra, vakum sızmasından sonra, numuneleri xgl içeren boyama tamponunda gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri inkübatörden çıkarın ve boyama tamponunu çıkarın.

Numuneleri ardışık bir etanol serisinde oda sıcaklığında her değişiklik için 30 dakika yıkayın. Son olarak, dokuları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca FAA fiksatifinde sabitleyin. Ardından FAA fiksatifini çıkarın ve% 70 etanol ekleyin.

Dokuları bir dijital kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin veya burada gösterilen bitkide daha sonra görüntülemek için dört santigrat derecede saklayın. Koyu mavi renk, TS O2 promotörü tarafından yönlendirilen GUS aktivitesini yansıtır. Oluk tepesi, aktif olarak bölünen hücrelere sahip genç yaprak ilkellerine sahiptir.

Bu, Gus aktivitesinin koyu mavi rengiyle gösterilen DNDP biyosentezi için yüksek oranda eksprese edilen TS O2 geni ile yansıtılır. Mavi renkteki lateral kök primordial de görülebilir ve kök ucunda da lekelenme görülebilir. Tekdüze olmayan sporadik model, hücre döngüsü fazına özgü ifadenin karakteristiğidir.

Arabidopsis bitkilerini dönüştürmek için çiçek daldırma yönteminin nasıl kullanılacağını ve transgenik fidelerde muhabir gus ekspresyonunu nasıl inceleyeceğinizi az önce gösterdik. Bu işlemi yaparken sağlıklı bitkilere sahip olmak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.