Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Bu prosedür, iki Arabidopsis transkripsiyon düzenleyicisi, kısaca SEU olarak yazılan seus ve lu holog veya LUH arasındaki in vivo protein protein etkileşimini test eder. Biyomoleküler floresan tamamlamasını kullanarak, seus, sarı bir floresan proteinin veya YFP'nin uç terminal fragmanına kaynaştırılır ve LUH, iki plazmit yapısının Y-F-P-D-N-A'nın C terminal fragmanına kaynaştırılır. Seuss, NYFP ve L-U-H-C-Y-F-P, etkileşimlerini test etmek için soğan epidermal hücrelerine bombardıman edilir.

Seuss ve LUH arasındaki bir etkileşim, çekirdeklerde YFP'nin uç terminal ve C terminal fragmanlarının birleşmesine neden olur ve bu da çekirdeklerde YFP floresansına yol açar. Karanlıkta 16 ila 20 saat inkübasyondan sonra, floresanı görselleştirmek için soğan epidermal kabukları bir floresan mikroskobu altında gözlenir. Merhaba, ben Maryland Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nden Dr.Zhi Lu'nun laboratuvarından Courtney Hollander.

Bugün size BioRad Helios gen tabancasını kullanarak soğan hücrelerinde protein-protein etkileşimini test etmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini ve protein Lokalizasyonunu test etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, her bir kartuş hazırlığı için kartuş hazırlama prosedürünü ayrıntılı olarak gösteren Woods ve Zeto 2008'in Joe Video Protokolünü izleyerek Helios gen tabancası için kartuşlar hazırlayın. 50 mikrogram toplam plazma DNA'sı, BIFC için 12.5 miligram altın parçacığı ve mililitre PVP çözeltisi başına 0.5 miligram ile karıştırılır. Aynı kartuş preparatını birleştirerek, varsayılan etkileşimli proteinlerin iki plazma DNA'sı Seuss, YFP'nin N terminal yarısına kaynaştı, kısaltılmış seus, NYFP ve LU Homolog, YFP'nin C terminal yarısına kaynaştı, kısaltılmış L-U-H-C-Y-F-P.

Kombine miktar, hazırlık başına 50 mikrogramdır ve kartuş başına 0.25 miligram altın başına bir mikrogram DNA'da 50'ye kadar kartuş verir. Her kartuş bir atış içindir. Kartuş hazırlığından sonra, altın parçacıklarının verimli bir şekilde itilip itilmediğini öğrenmek için kartuşları test edin.

Bir Petri kabının etrafına kare bir paraform parçası sarın. Ardından helyum basıncını 150 ila 200 PSI arasına ayarlayın ve yeni yapılan kartuşları param karesine ateşleyin. Parfüm üzerinde soluk altın parçacıklarını gözlemleyin.

Farklı miktarlarda altın parçacıkları, farklı helyum basınçlarında parfüm üzerine itilebilir. Ancak, önemli bir fark yoksa, bombardıman için daha düşük basıncı seçin. Bu test aynı zamanda her atış ilerlemesinin kapsadığı alanı da gösterir.

Soğan dokularını hazırlamak için temiz ve keskin bir tıraş bıçağı kullanarak büyük sarı soğanın dış kabuğunu soyun. Dört ila beş katman derinliğinde iki x sekiz santimetre dikdörtgen bir alan kesin. Dikdörtgen soğan dokusunu çıkarın ve dıştaki iki katmanı atın.

Soğanın kalan katmanlarını yaklaşık 1,5 santimetre karelik parçalar halinde kesin. Soğan parçalarını, üç mm'lik filtre kağıdı dairelerinden oluşan bir Petri kabına yerleştirin. Steril su ile nemlendirilmiş, Petri kabını örtün.

Soğan parçaları bombardımana hazır. İlk olarak, kartuşları beyaz yuvarlak kartuş tutuculara yerleştirin: farklı plazmit yapıları içeren kartuşları farklı kartuş tutuculara yükleyin. Her kartuş tutucu, 12 atış için 12 adede kadar kartuş tutabilir.

Buraya üç farklı tutucu yüklenir. İlk tutucu, karnabahar mozaik virüsünden 35 S-G-F-P-A güçlü ve kurucu promotör içeren kartuşlara sahiptir. Bu plazmit pozitif bir kontrol görevi görür.

İkinci tutucu, eşit miktarda S-E-U-N-Y-F-P ve L-U-H-C-Y-F-P içeren deney kartuşları ile doldurulur. Üçüncü kartuş tutucu, disk omurga vektörü ve LUH disk baharatının eşit molar karışımını içeren kartuşlarla doldurulur. Bu aynı zamanda negatif bir kontrol görevi görür.

Pili ve yeni namlu astarını Helios gen tabancasına yerleştirin. Hem namlu astarının hem de tabancanın ilgili O-ringlerinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, kartuş tutucusundaki 12 numaralı işaret tabancanın üst kısmına bakacak şekilde gen tabancasına boş bir kartuş tutucu yerleştirin.

Doğru takıldığından emin olmak için kartuş tutucuyu bir veya iki kez ilerletin. Ardından tabancayı helyum tankına takın ve basıncı 150 ila 200 PS arasında ayarlayın. Kulak koruması takıyorum ve tetiği çekerken yan düğmeyi basılı tutarak silahı birkaç kez ateşliyorum. Tabancayı boş kartuş tutucusu ile ateşlemek, dolu tabanca haznesini temizler ve basıncın sabit olmasını sağlar.

DNA'yı çekmeden önce, burada bir parça soğan çekmek, arka plan floresansı için negatif bir kontrol olabilir. DNA kaplı altın parçacıklarını çekmek için boş kartuş tutucuyu çıkarın ve pozitif kontrolü içeren ilk dolu kartuş tutucuyu takın. Kartuş tutucuyu, ateşleme amaçlı kartuş kartuş tutucunun altına yerleştirilecek şekilde ilerletin.

Şimdi soğan parçalarını, soğanın en iç tabakası yukarı bakacak şekilde boş bir Petri kabının ortasına yerleştirin. Gen tabancasının namlu astarını Petri kabının üzerine koyun ve silahı ateşleyin. Bir sonraki kartuşa ilerleyin ve farklı bir soğan parçası çekin.

Dört ila beş parça soğan vurulana kadar bu adımı tekrarlayın. Her soğan parçası, atıştan sonra yalnızca bir kez vurulur. Deney kartuşlarını çekmek için bombardımana tutulan soğan parçasını nemli üç mm filtre kağıdı içeren bir Petri kabına aktarın.

Kartuş Holden olarak değiştirin. İkincisi, kirlenmeyi önlemek için namlu astarını değiştirmeyi unutmayın. Pozitif kontrol için gösterildiği gibi dört ila beş soğan parçası çekin.

Ardından kartuş Holden ile değiştirin. Üç numara, negatif kontrol DNA'sını içerir. Ve yine, dört ila beş soğan parçası vurun.

Kirlenmeyi önlemek için namlu astarını değiştirin. Bombardımandan sonra. Soğan parçalarını içeren Petri kaplarını kapaklarla kapatın.

Kurumasını önlemek için paraform ile sarın. Soğan parçalarını oda sıcaklığında karanlıkta 16 ila 48 saat inkübe edin. Bombardıman bittikten sonra, gen tabancasını helyum tankından ayırmadan önce gazı kapatın ve basıncı boşaltın, namlu astarını sökün ve kartuş tutucuyu ve kullanılmış kartuşları çıkarın.

Son olarak, kartuş tutucuları ve namlu gömleklerini sabunlu su ve sonicate ile bir behere batırarak temizleyin. 20 dakika boyunca. Daha sonra, tüm sabun kalıntılarını gidermek için suyla durulayın.

Bir saat boyunca %70 etanol içinde bekletin ve ardından kağıt havlu üzerinde kurulayın. Bombardımandan 16 ila 20 saat sonra soğan parçalarını gözlemlemeye devam edin. Bombardımana tutulan soğan parçalarını oda sıcaklığında 16 ila 20 saat kuluçkaya yatırdıktan sonra, soğanın iç epidermisinden tek bir hücre tabakasını yavaşça soymak için düz uçlu forseps kullanın.

Bu, bombardıman sırasında doğrudan silaha bakan katmandır. Soyulmuş tabakayı, bir kapak kaymalı bir slayt kapağı üzerindeki bir damla suya yerleştirin. Ancak baloncukları en aza indirmeye dikkat edin.

Zes axio gözlemcisi gibi bir floresan mikroskobu kullanarak GFP veya YFP floresansını gözlemleyin, burada mikroskobun parlak alanı altında gösterilen Z noktası. Hücrelerin canlı olduğundan emin olmak için önce sitoplazmik akışı kontrol edin. Bunu yapmak için.

Soğan dokusunu ısıtmak için slaytı birkaç dakika parlak alan ışığına maruz bırakın ve ardından hareketli plastikleri arayın sitoplazmik Akışı görmek her zaman kolay değildir, bu nedenle net bir şekilde görünmüyorsa cesaretiniz kırılmasın. Floresan tespiti için, GFP veya YFP için uygun uyarma ve algılama filtreleri kullanın. Ayrıca, floresan olmayan bir plazmit ile çekilen soğan parçaları olan negatif kontrolleri de kontrol edin.

Yaralı hücrelerden, döküntülerden ve soğanlardan soluk sarı sinyaller görünebilir. Ayrıca, pozitif kontrolleri kontrol edin. Yapısal olarak eksprese edilen floresan raportör içeren plazmit.

GFP floresansı tüm hücrelerde olmasa da bazı hücrelerde görülür. Hava kabarcıkları ayrıca arka plan floresansına da neden olabilir. Soğan epidermal hücrelerinden gelen görünür GFP sinyalleri, kartuşların, soğan dokularının ve gen tabancasının ateşlendiğini gösterir.

Burada gösterilen, 35 SGFP pozitif plazmidden gözlemlenen güçlü floresandır. Güçlü floresan, hem çekirdek hem de sitoplazma dahil olmak üzere tüm hücrede görülür. Parlak alan görüntüsü, hücrelerin ve çekirdeklerin karşılık gelen ana hatlarını görmeyi sağlar.

Her hücre dönüştürülmez. Seuss, NYFP ve L-U-H-C-Y-F-P deneysel kombinasyonu soğan hücrelerine bombardıman edildiğinde YFP floresan sinyali soğan hücresi çekirdeğinde tespit edilir, bu da Seuss NYFP ve L-U-H-C-Y-F-P'nin in vivo olarak etkileşime girdiğini gösterir. Bununla birlikte, bu etkileşim aracılı floresan, pozitif kontroldeki 35 SGFP aracılı floresanstan önemli ölçüde daha zayıftır.

Ek olarak, SEUS ve LUH transkripsiyon faktörleri çekirdeklerde lokalizedir. Bu nedenle, YFP floresansı sadece çekirdekte gözlenir. Ayrıca, floresan hücrelerin sayısı 35 SGFP pozitif kontrolününkinden önemli ölçüde daha düşüktür.

Bunun nedeni, B FFC'nin yalnızca her iki ortak plazmid de aynı soğan hücrelerinde eksprese edildiğinde çalışmasıdır. Negatif kontrolden beklendiği gibi, disk omurgası, vektör ve L-U-H-C-Y-F-P karışımı içeren üç numaralı kartuş tutucu ile bombardıman edilen soğanlarda floresan sinyali tespit edilmedi. BioRad Helios gen tabancası sistemini kullanarak protein protein etkileşimlerini test etmek için soğan Hücrelerini nasıl bombardıman edeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, uygun pozitif ve negatif kontrolleri kullanmayı hatırlamak ve BIFC floresansının sinyalde daha zayıf ve floresan hücre sayısında daha az olabileceğini bilmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.