Name: Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin fare blastosistlerinden trofoblast kök hücre türetme ve kültür koşullarında sürdürme yöntemlerini. Bu teknik plasenta gelişimi ve embriyonik doku araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Janet Rossant orijinal protokol için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe CA106308 WH Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, fare blastosist hazırlanması ve TS hücre hatlarının kurulması açıklanmaktadır. Doğal çiftleşme için set ve süper ovulasyon indüksiyon dahil olmak üzere blastosist koleksiyon, önce Genel fare manipülasyonlar temelde Nagy ve ark tarafından gösterilen standart bir protokol izleyin. 2003 (pp146 150). TS hücrelerinin türetilmesi ve bakım <ol><li> Kur, faiz fareler arasında üreme çapraz. </li><li> Besleyici hücreler olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) hazırlayın. Blastosist koleksiyon İki gün önce, MEFS (2 x 10 6 hücre) 100 mm yemekler kaplanmıştır. Ertesi gün, bu hücrelerin, 37 ° C,% 5 CO 2 saat inkübasyon için 2 mitomisin C (20 mg / ml) içeren 10 ml TS orta ile tedavi edilir . Bu hücreler PBS ile iki kez yıkanarak takip eder. Mitomisin C muamele edilen hücreler, daha sonra 12 kuyucuğu (1 x 10 5 hücre / iyi) numaralı seribaşı. </li><li> Blastosist toplama (3,5 DPC, bir gün olarak anılacaktır) günü, MEF kültür ortamı TS orta artı 1x FGF4/Heparin (0.5 ml / kuyu) tarafından değiştirilir. </li><li> Rahim toplanması için hazırlık: fare euthanize ve rahim (Şekil 1A) bulun. </li><li> Çıkarın, serviks (mesane arkasında bulunan) forseps ile tutarak rahim ve rahim ve serviks (Şekil 1B) birleşme kesen. Rahim çekin uzak membran ve yağ dokuları Döşeme ve yumurtalık (Şekil 1C) ile birleşme altında rahim kesmek. TS orta küçük bir hacmi (0,2 ml) 60 mm plaka uteri (Şekil 1D) yerleştirin. </li><li> 1 ml 26 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak TS orta ile her uterus boynuzu yıkayın. Iğne rahim tabanı içine yerleştirin ve yavaş yavaş yeni bir 60 mm plakası içine 1 ml TS orta ile yıkayın. Rahim şişirilmiş ve kızarma sırasında tamamen kapsayacak şekilde genişletilmesi gerekmektedir. </li><li> Toplayın ve bir ağız kontrollü pipet kullanarak TS orta içeren temiz bir 12 plaka dikkatlice blastosist transferi. 12 kuyucuğu TS aracılığıyla seri transfer blastosist üç kez yıkayın. Bir de ortalama 37 mitomisin C-MEF besleyiciler tedavi ve kültürü içeren bir 12-plaka blastosist (Şekil 2A) ° C,% 5 CO 2. </li><li> Blastosist zona pellusida yumurtadan çıkar ve 24 ila 36 saat içinde kuyulara eklenecektir. Küçük bir akıbet 3. gününde kolaylıkla görülecektir. 500 ul taze TS orta artı 1x FGF4/Heparin kültürler besleyin. </li><li> 4 veya 5 günde, blastokist akıbet boyutuna bağlı olarak ayrıştırılmasıyla için hazır olmalıdır. TH hücre ayrıştırılmasıyla için ideal boyut Şekil 3B gösterilmiştir. Kültürlerin 0.5 ml PBS ile bir kez yıkayın. 5 dakika 37 ° ° C,% 5 CO 2 için 100 ml% 0.25 tripsin / EDTA ve inkübe ekleyin. P100 pipetteman ile kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleme küçük öbekler halinde Break sonucudur. TS-70cm-1.5F4H (% 30 TS orta,% 70 MEF-CM artı 1.5x FGF4/Heparin) kuyunun içine ekleyerek trypsinization durdurun. Ayrıştırılmasıyla 8 saat sonra orta değiştirin ve her 2 günde hücreleri beslemeye devam. </li><li> 6 ve 10 gün (son derece değişken) arasında TS hücre kolonileri görülebilir. Onlar açık bir koloni sınır (Şekil 2C) morfoloji gibi yassı epitel levha var. 2 günde kültürlerin beslemeye devam </li><li> TS hücreleri% 50 confluency (genellikle 15 ve 20 gün arasında) ulaştığınızda, PBS ile bir kez yıkayın ve 100 ml% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin. Trypsinization sırasında yakın bir tek hücre süspansiyonu sağlamak için yukarı ve aşağı Pipet. Mitomisin C-MEF besleyiciler tedavi (2.5 x 10 5 cells/6-well veya 5 x10 5 cells/60mm plaka) içeren 6-iyi ya da 60mm plakalar yeni TS-70cm-1.5F4H ve transfer ekleyerek trypsinization durdurun. </li><li> Değişim ve orta 8 saat geçtikten sonra 2 gün her kültürleri beslemeye devam edin. </li><li> MEF besleyiciler bir veya iki pasajlar daha sonra (3-5 gün pasajlar arasında), TS hücreleri onlar olmadan kültür olabilir. MEFS trypsinization sonra TS hücrelerden daha çok daha hızlı kültür plaka takmak Çünkü, yapışık oranı böyle bir fark MEF besleyiciler TS hücreleri ayırmak için kullanılabilir. Kültür hücreleri geçtikten sonra 37 dakika süreyle 30 ° C,% 5 CO 2 kuluçkaya yatmaktadır. En MEFS plaka takmak ve TS nüfus süspansiyon kalır. Yeni bir plaka süpernatantı aktarın. Saf bir TS nüfus elde etmek için çeşitli pasajlar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> TS-70cm-1.5F4H TS hücreleri korumak ve her 4 gün geçmesine (1:10 - 1:20 bölünmüş) ya da kültürün% 70 confluency ulaşır. Yüksek yoğunluklu (01:05 bölünme daha yüksek) aşırı konfluent farklılaşma neden olabilir ya da kültür hücreleri geliyorsunuz. </li><li> TS hücrelerinin kimliğini bir hücre belirteci, Cdx2 (Şekil 3) immün teyit edilebilir. </li></ol> Donma TS hücreleri <ol><li> Dondurma orta olarak (% 50 FBS,% 30 TS orta ve% 20 DMSO) 2x hazırlayın. </li><li> Cotrypsinization tarafından llect TS hücreleri, 6 dakika süreyle santrifüj 450g. 2x dondurma orta eşit hacmi ile TS orta onları tekrar </li><li> , Yavaş yavaş -70, izopropil alkol odası kullanarak hücrelerin Freeze ° C ve 24-48 saat sonra sıvı azot transfer. </li><li> (Confluent% 70) 60 mm plaka genellikle 2 şişeleri tutulur. </li></ol> TS hücreleri Çözülme <ol><li> Flakon çözünme hızla 37 ° C, (450g, 6 dakika) santrifüj tarafından 10 ml TS medya onları toplamak ve% 30 TS medya, 70cm 1.5F4H tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Hücrelerin Bir flakon, 60 mm plaka numaralı seribaşı. </li></ol> TGC içine TS hücre farklılaşması Trofoblast dev hücreler (TGCs) içine TS hücrelerin farklılaşması, MEF-CM, FGF4 ve heparin çekilmesi ile indüklenen olabilir. TGC fenotip (büyük çekirdekleri), dört gün indüksiyon sonra tespit edilebilir (Tanaka ve ark, 1998 ve Chiu ve ark 2008) . TGC farklılaştırılmış kültürü bu işaretleyici (Şekil 4A) p450scc, immün ifade algılar. PI Flow sitometrik analizi (propidium iyodür) boyanan hücreler daha yüksek DNA içeriği (Şekil 4B) içeren farklılaşmış hücrelerin varlığı gösterir. Bu sonuçlar, TS hücreleri polyploid TGCs haline endoreduplication geçmelerini öneriyoruz. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 fare uteri Diseksiyon. (A) uteri yeri oklarla gösterilir. (B) gösterildiği gibi, rahim ve serviks kavşak boyunca kesin. (C), over (OV) altında yumurtalık (OD) altında rahim kesin. Uteri (D) Görüntü. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Temsilcisi resimleri fare blastosist, blastosist akıbet ve trofoblast koloni göstermektedir. (A) E3.5 toplanan bir fare blastosist gösterilmiştir. ICM, iç hücre kütlesi MT, duvar trophectoderm; PT, kutup trophectoderm. (B) MEF besleyiciler trofoblast akıbet gösterilmiştir. TS, trofoblast kök hücre. (C) trofoblast kök hücre kolonisi MEF besleyiciler açık bir kenar gösterir. Oklar hücre sınırı göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 analiz immün TS hücrelerinin belirlenmesi. TS (AD) ve ES (kontrol, EH) hücreleri işaretleyici kimlik tabi. Hücreler Oct4 (A, E) ya da Cdx2 (B, F) tanımak için antikorlar ile boyanmış ve birleştirilmiş görüntüler sunulan DAPI (C, G) (D, H) tarafından zıt. Ölçeği bar, 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 TS hücrelerinin in vitro Farklılaşma. (A) kültür ayrım yapılmamış (Undiff) veya farklılaştırılmış (Diff) hücreleri, TGC bir marker ifade için incelenmiştir p450scc (yeşil), DAPI (kırmızı) ile zıt. (B) PI ile boyandı farklılaşmış hücrelerin, flow sitometrik analizi, DNA içeriği (M2, dörtten fazla kopya M1, 03:58 kopya) ölçer. M2 nüfusu polyploid trofoblast hücreleri temsil eder.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Bu videoda, biz süreci TS hücre hatları kurmak için uteri ve deneysel prosedürleri E3.5 blastosist toplamak göstermektedir. Ayrıca stemness TS hücreleri korumak ve farklılaşmış hücrelerine farklılaşma ikna etmek için durumu açıklar. Saf TS hücre hatları elde etmek için iki kritik adımlar akıbet ayrıştırılmasıyla için zamanlama (adım 9) ve ilk geçiş işleme (adım 11). Bu geniş blastosist adım 11 (Kunath ve ark, 2005) TS kolonilerin adım 9 ya da aşırı çoğalma (&gt;% 50 confluency) büyümek sonra ilkel endoderm kökenli hücre...

Reaktifler TS orta: RPMI-1640,% 20 FBS, 1 mM sodyum piruvat, 100 mM beta-merkaptoetanol ve 100 mg / ml penisilin-streptomisin. Mitomisin C: 2 mg mitomisin C (Sigma M-0503) 2 ml PBS içinde çözülür ve 200 ml TS orta (10 ng / ml) 2 ml içine bu karışımı ekleyin. Kullanana kadar -20 ° C&#39;de 20 alikotları (10 ml) ve mağaza olun. 100 mm plaka başına bir kısım ekleyin. Fare embriyonik fibroblast koşul orta (MEF-CM): 100 mm plakalar Levha MEFS (1 x 10 6 / plaka). Ertesi gün başına 10 ml TS çanak orta ekleyin ve 48 saat boyunca kültür devam ediyor. Bunları filtre (0.45 mm) ve 35 ml alikotları -20 ° C&#39;de mağaza, kültür ortamı toplayın. 4 saklanabilir gerekli her kısım ° C çözülme MEFS konfluent haline gelmeden CM iki veya daha fazla partiler için hazırlamak için kullanılabilir. PBS / BSA: 0.45 mm şırınga filtresi ile filtre PBS (10 ml), BSA, fraksiyon V (Sigma A3311,% 0,1 (w / v)) çözülür ve 1 ml 1,5 ml tüpler alikotları yapmak. Mağaza -70 ° C ve FGF4 hazırlamak için gerekli zaman bir tüp Çözülme. FGF4 (1000x): 1 ml PBS / BSA çözüm ile yeniden süspanse liyofilize FGF4 (Sigma F8424, 25 mg). -70 Iyice karıştırınız ve 1.5 ml tüpler ve depoya 10 alikotları (100 ml) ° C Gerektiğinde her tüp çözülme ve saklamak kalan 4 ° C, tekrar dondurmak yok. 1x FGF4 (25 ng / ml) elde etmek için, TS orta 1000 kat sulandırınız. Heparin (1000x): 1 nihai konsantrasyonu PBS içinde süspanse edin heparin (Sigma H3149, 10.000 adet) mg / ml (1000x). 1.5 ml tüpler ve mağaza içine 100 ml alikotları olun -70 ° C Çözülme alikotları ve kalan 4 saklamak ° C, yeniden dondurucu yoktur. 1x heparin (1 ng / ml) elde etmek için, TS orta 1000 kez sulandırınız.

blastosist fare trofoblast kök hücre türetilmesi

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Trophectoderm belirlenmesi memeli gelişiminin erken farklılaşma olayları biridir. Trophectoderm aracılık implantasyon türetilmiştir ve plasentanın fetal trofoblast soy üretir. Sonuç olarak, bu soy gelişimi embriyonun hayatta kalmak için çok önemlidir. Fare blastosist trofoblast kök (TS) hücreleri türetilmesi ilk Tanaka tarafından tarif edilmiştir<em&gt; Ve ark.</em&gt; 1998. Uygun stimülasyon sonra sahne ve hücre tipi özel işaretleri trofoblast özel mülkiyet ve anlatım TS hücreleri korumak için yeteneği erken plasenta olayları yansıtan sayede trofoblast soy geliştirme araştırmak için değerli bir model sistem sunmaktadır. Ayrıca, trofoblast hücrelerinin doğal genom amplifikasyon geçiren birkaç somatik hücre tipleri biri. Trofoblast polyploidization altında yatan moleküler yollar çözülmeye başlamış olmasına rağmen, trofoblast genom amplifikasyon fizyolojik rolü ve avantajı büyük ölçüde zor kalır. Kültür polyploid trofoblast hücreleri diploid kök hücre gelişimi bu<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistem, sağlık ve hastalık, genom replikasyonu ve istikrarsızlık düzenleyici bir mekanizma nedenlerine açıklık için mükemmel bir araç. Burada Chiu yılında yayımlanan değişiklik ile önceki raporlara göre bir protokol<em&gt; Ve ark.</em&gt; 2008.

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Trofektoderm belirginleşmesi, memeli gelişimindeki en erken diferansiyasyon olaylarından biridir. ...'dan türetilen trofoblast soy hattı...

Bu prosedürün genel amacı, fare blastosistlerinden TS hücreleri elde etmektir. Bu işlem, öncelikle gebe farelerden uterus boynuzlarının izole edilmesi ve blastosistlerin geri kazanılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, blastosistlerin meth besleyici hücreler üzerinde ve TS hücrelerinin büyümesini destekleyen koşullarda kültüre edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, TS kolonilerini genişletmek ve nihayetinde meth besleyicilerin yokluğunda TS hücrelerini kültüre etmektir. Prosedürün son adımı, kriyokoruma gerçekleştirmek ve trofoblast farklılaşmasını indüklemek için kök hücre özelliklerinin korunduğu TS hücrelerini kültüre etmektir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla, farklılaşmamış TS hücrelerinde bir trofoblast kök hücre belirteci olan IE CDX two'nun veya trofoblast dev hücrelerine olgunlaştıktan sonra bir farklılaşmış belirteç olan IEP four 50 SCC'nin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Rochester Tıp Merkezi Biyomedikal Genetik Bölümü'ndeki laboratuvardan Shani Chu. Bugün sizlere trofoblast kök hücre kültürü prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, trofoblastların büyümesini ve farklılaşmasını ve sağlıklı bir plasenta oluşumund

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Verimli, zamanında ve sırayla blastosist benzeri hücreler üreten insan blastoidlerinin oluşumunu özetleyen bir protokol.

İnsan Blastoidlerinin Modellenmesi Blastosist Gelişimi ve İmplantasyonu için Protokol

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Öğrenin fare blastosistlerinden trofoblast kök hücre türetme ve kültür koşullarında sürdürme yöntemlerini. Bu teknik plasenta gelişimi ve embriyonik doku araştırmaları için temel oluşturur.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Daha fazla video keşfet