Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kantitatif PCR kullanarak zümrüt kül ağacı böceğünün dokularındaki ve gelişim aşamalarındaki gen ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, larval dokuların diseksiyonu ve gelişim aşamalarının kategorizasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, triol reajen kullanılarak dokulardan ve gelişim aşamalarından RNA ekstraksiyonu yapılır; ardından bu RNA, birinci zincir cDNA sentezlemek için kalıp olarak kullanılır. Birinci zincir cDNA sentezini takiben kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir.

Döngü eşiği (cycle threshold) değerlerinden elde edilen toplam değişim verilerine dayanarak, hedef genin çeşitli larva dokularında ve gelişim aşamalarında farklılaşan ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Kantitatif R-T-P-C-R amplifikasyonları sonrası. Merhaba, ben Ohio State Üniversitesi Entomoloji Bölümü'ndeki bu laboratuvarın sorumlu araştırmacısı (PI) Prakash Mi.

Laboratuvarım temel olarak emal, lash, burer ve ash etkileşimlerinin genomik veya moleküler yönlerine odaklanmaktadır. Emal, lash Burer veya EAB, Çin kökenli egzotik istilacı bir zararlıdır ve Kuzey Amerika genelindeki ash popülasyonlarının varlığını ciddi şekilde tehdit etmektedir. Bugün size, qPCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak EAP'de gen ekspresyon analizi öğrenmek için bir protokol göstereceğiz.

Bu protokolde yer alacak laboratuvar üyeleri; val diseksiyonlarını gerçekleştirecek olan Swapna pri ou, RNA izolasyonunu gösterecek olan bin Bandari ve son olarak qPCR analizini inceleyecek olan Lauren Rivera Vega'dır. Laboratuvarımızda bu prosedürü ayrıca ash gen ifadesini incelemek için de kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, zümrüt kül ağacı kurdu (emerald ash B) veya EAD larvalarını nemli doku kağıdı üzerine yerleştirin. Diseksiyonlar gerçekleştirilene kadar, diseksiyon boyunca tamponun soğuk kalmasını sağlamak için taze hazırlanmış 1x fosfat tamponlu salin veya PBS'yi buz üzerinde tutun.

Başlamak için, EAB larvalarını ince disseksiyon iğneleriyle disseksiyon plakasına sabitleyin. Ardından disseksiyon plakasına soğuk 1x PBS ekleyin. İlk olarak larvaların başlarını ince bir disseksiyon makasıyla kesin.

Ardından, larvaların son abdominal segmentini bir saatçi pensi kullanarak çıkarın. Kütikülü larval gövdeden kaldırın, ardından bir makas kullanarak gövde boyunca bir kesi yapın. Bağırsakları yırtmamaya dikkat edin.

Kesi yapılırken, orta bağırsak dokusunu yağ cisimcikleri ve bağ doku gibi diğer dokulardan dikkatlice ayırın. Ardından, yağ cisimciği kontaminasyonu olmadığını sağlamak için dokuyu taze 1X PBS tamponu ile durulayın. Orta bağırsağı, 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpü içindeki 500 µL önceden soğutulmuş triol reaktife aktarın.

Ardından, yağ vücudu dokusunu pens kullanarak izole edin ve 500 µL soğutulmuş triol reajeni içeren 1,5 mL'lik bir eend orph tüpüne aktarın. Son olarak, yapışan tüm dokuları sıyırarak larva gövdesinden kütikula dokusunu izole edin. Bu işlemi yaparken doku bütünlüğüne zarar vermemeye dikkat edin.

İzole edilen kütikula dokusunu taze PBS tamponu ile durulayın ve 500 µL soğutulmuş triazol reaktifi içeren 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne aktarın. İzole edilen yağ vücudu kütikula ve orta bağırsak dokuları, RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklanabilir. RNA ekstraksiyonu hazırlığı için çeşitli EAB örneklerini gelişim aşamalarına göre sınıflandırın.

Bu aşamalar yıldızlarda, PrepU'da ve yetişkinlerde birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü evreleri içerir. RNA ekstraksiyonuna başlamak için önce, 1,5 mililitre triol içeren einor tüplerinde dokuları plastik havanlarla homojenize edin. Homojenizasyon sonrası, her örneğin toplam hacmini triol reaktifi ile bir mililitreye tamamlayın.

Gelişim aşamaları için, tüm hayvanı bir havan ve havan eli yardımıyla sıvı azot içerisinde homojenize edin. Ardından, homogenatın bir alikotunu bir mililitre triol içerisine ekleyin. Örnek tüplerini bir mililitre triol ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kloroform eklendikten hemen sonra her tüpe 200 microliter kloroform ekleyin. Tüpleri yaklaşık 15 saniye boyunca şiddetli bir şekilde çalkalayın. Ardından tüpleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika daha inkübe edin.

Ardından, numuneleri 2 °C'de 15 dakika boyunca 12, 000 GS'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra RNA, sulu fazda yer alacaktır. Sulu faz hacmi 600 µL veya toplam triol hacminin %60'ı olmalıdır.

Sadece sulu fazı dikkatlice uzaklaştırın. Sulu fazın altındaki maddelerin varlığı, ekstrakte edilen RNA'nın kontamine olmasına neden olacaktır. Ardından sulu fazı, uygun şekilde etiketlenmiş 1,5 mililitrelik bir einor tüpüne aktarın.

Sulu faz karışımından RNA'yı çöktürmek için, her tüpe 0,5 mililitre izopropil alkol ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpleri iki derece santigrat sıcaklıkta, 12.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, tüplerdeki S natin'i uzaklaştırın.

RNA, tüpün dibinde oluşan jel benzeri pellet içerisinde yer alır. Pelleti %75 etanol ile yıkayın; vorteks ile karıştırarak, her 1 mL karışım için en az 1 mL %75 etanol ekleyin. Ardından tüpleri 2 °C'de, 7.500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Tüplerdeki süpernatantı atın. Tüpleri küçük masaüstü santrifüjde bir dakika daha santrifüjleyin. Dikkatli pipetleme yaparak tüpte kalan fazla süpernatantı uzaklaştırın.

Tüpü açık bırakın ve peletin beş ila 10 dakika boyunca havada kurumasını sağlayın. Peleti aşırı kurutmamaya dikkat edin, çünkü bu durum hava kurutmadan sonra çözünürlüğünü önemli ölçüde azaltacaktır. Peleti dietil perkarbonat veya DEPC işlem görmüş suda yeniden süspanse edin.

Peleti yeniden süspande etmek için kullanılan su miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. Küçük bir pelet için 50 µL, büyük bir pelet için ise 100 µL dep sea işlem görmüş su kullanın. Pipet ucunu birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek peletin dep sea işlem görmüş su içinde tamamen çözünmesini sağlayın.

Pellet çözündükten sonra, örneği 10 dakika boyunca 55 °C'de bekletin. Ardından, her bir RNA örneğinin konsantrasyonunu bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak ölçün. Son olarak, RT-PCR için Invitrogen SuperScript birinci zincir sentez sistemini kullanarak ilgili RNA örnekleri için birinci zincir cDNA sentezini gerçekleştirin.

Bu prosedür, bu protokolün yazılı kısmında bulunabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR veya Q-R-T-P-C-R'ye başlamak için her primeri 60 °C erime sıcaklığına ve yaklaşık 100 baz çifti ürün boyutuna sahip olacak şekilde tasarlayın. Bu deney için ilgi duyulan gen olarak AP par one kullanılmıştır.

Verilerin daha sonra analiz edilmesi ve normalizasyonu için bir referans gene veya iç kontrol gereklidir. Burada, referans gene olarak ribozomal protein a P RRP one kullanılmıştır. Ardından, her bir kuyucuk için örnek adını belirten bir şablon ve QR tpcr plakası tasarlayın.

Her gen için standartları ve örnek başına en az iki teknik tekrarı dahil etmeyi unutmayın. Ardından QRT PCR cihazını açın ve CFX 96 cihazı için plakayı hazırlamak üzere döngü parametrelerini girin. İlk olarak, her kuyucuk için her geni ayrı bir tüpte hazırlayarak master mix'i hazırlayın.

Master mix; iki mikrolitre nükleaz içermeyen su, dört mikrolitre 2.5 x cyber green, bir mikrolitre ileri primer ve bir mikrolitre geri primerden oluşan toplam sekiz mikrolitre hacme sahiptir. Önceden tasarlanan şablona göre, her kuyucuğa iki mikrolitre CDNA ekleyin. Ardından, her kuyucuğa sekiz mikrolitre master mix ekleyerek reaksiyon başına toplam 10 mikrolitre hacim elde edin; numunenin iyice karıştığından emin olmak için pipetle yukarı aşağı hareketler yapın.

Ucun üzerinde sıvı kalmadığını kontrol edin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her örnek için yeni bir uç kullanın. Tüm plaka hazırlandıktan sonra, plakayı optik bant ile kapatın.

Yağ varlığı okumayı etkileyebileceği için banda dokunmaktan kaçının. Ardından, kuyucuklardaki tüm ürünlerin santrifüj sonrası plakanın dibinde olduğundan emin olmak için plakayı 500 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Plakanın altında buz veya su olmadığını kontrol edin.

Son olarak, plakayı QR TPCR cihazına yerleştirin ve larval EAB için temsilci sonuçları içeren PCR programını çalıştırın. Diseksiyon ve QR TPCR burada gösterilmiştir. Larva EAB diseksiyonu, larvanın ortasındaki orta bağırsağı ortaya çıkarmalıdır.

EAB larvasının orta bağırsağı burada gösterildiği gibi izole edilmiştir, ortalama göreceli ekspresyon değerleri veya RAV'lar. Paratrophin geni AP par one için kütikula, orta bağırsak ve yağ cisimcikleri dahil olmak üzere farklı larva dokularına ait değerler burada gösterilmektedir. EAB'ye özgü ribozomal protein ARP one, ilgilenilen gen için elde edilen verilerin normalizasyonu için iç kontrol olarak kullanılmıştır.

Farklı larva dokuları için AP par one'nin göreceli kat değişimi çıkarılmıştır. Kütikula dokusu en düşük ekspresyonu göstermiş ve bu nedenle EAB'nin birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü larva evreleri dahil olmak üzere farklı gelişim aşamalarındaki AP Perry one için kalibratör örnek ortalama RV'ler olarak alınmıştır.

PrepU ve yetişkinler, verileri normalize etmek için internal kontrol olarak aprp one kullanılarak belirlendi. Çeşitli gelişim aşamaları için AP Perry one'ın göreli kat değişimi belirlendi. Burada PrepU örneği en düşük mRNA seviyesini gösterdi ve bu nedenle kalibratör olarak alındı.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, yan diseksiyonların nasıl yapılacağını ve ardından yan doku ile Emerald ra'nın çeşitli gelişim aşamaları kullanılarak kantitatif R-T-P-C-R ile gen ekspresyon analizinin nasıl yürütüleceğini gösterdik. Dokular arası çapraz kontaminasyon oluşmaması için diseksiyon sırasında dikkatli olmalısınız. Ayrıca, Q-R-T-P-C-R işlemi sırasında ilgili örneklerin ilgili PCR kuyucuklarına pipetlendiğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır.

İşte böyle. Videomuzu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.