Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kantitatif PCR kullanarak zümrüt dişbudak böceğinin dokularında ve gelişim evrelerinde gen ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, larva dokularının diseksiyonu ve gelişim evrelerinin kategorizasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, dokulardan ve gelişim evrelerinden triol reaktifi kullanılarak RNA ekstrakte edilir ve ardından bu RNA, birinci zincir cDNA üretmek için kalıp olarak kullanılır; birinci zincir cDNA sentezinin ardından kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir.

Döngü eşik değerlerinden elde edilen toplam değişim verilerine dayanarak, hedef genin çeşitli larva dokularında ve gelişim aşamalarında diferansiyel ekspresyon gösterdiği sonuçlar elde edilir. Kantitatif R-T-P-C-R amplifikasyonları sonrası. Merhaba, ben Prakash Mi, Ohio State University Entomoloji Bölümü'ndeki bu laboratuvarın baş araştırmacısıyım.

Laboratuvarım temel olarak emal, lash, burer ve ash etkileşimlerinin genomik veya moleküler yönlerine odaklanmaktadır. Emal, lash Burer veya EAB, Çin'den gelen egzotik istilacı bir zararlıdır ve Kuzey Amerika genelindeki ash popülasyonlarının varlığını doğrudan tehdit etmektedir. Bugün size, QPCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak EAP'de gen ekspresyon analizi öğrenmeniz için bir protokol göstereceğiz.

Bu protokolde yer alacak laboratuvar üyeleri; val diseksiyonlarını gerçekleştirecek olan Swapna pri ou, RNA izolasyonunu gösterecek olan bin Bandari ve son olarak qPCR analizini inceleyecek olan Lauren Rivera Vega'dır. Bu prosedürü laboratuvarımızda kül ağacının gen ifadesini çalışmak için de kullanmaktayız.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, zümrüt kül ağacı böceği veya EAD larvalarını nemli doku kağıdı üzerine yerleştirin. Diseksiyonlar gerçekleştirilene kadar, diseksiyon boyunca tamponun soğuk kalmasını sağlamak için taze hazırlanmış 1x fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS'yi buz üzerinde tutun.

Başlamak için, EAB larvalarını ince diseksiyon iğneleriyle diseksiyon plakasına sabitleyin. Ardından diseksiyon plakasına soğuk 1x PBS ekleyin. İlk olarak larvaların başlarını ince bir diseksiyon makasıyla kesin.

Ardından, larvaların son abdominal segmentini bir saatçi pensi kullanarak çıkarın. Kütikülü larva gövdesinden kaldırın ve ardından bir makas kullanarak gövde boyunca bir kesi yapın. Bağırsakları yırtmamaya dikkat edin.

İnsizyon yapılırken orta bağırsak dokusunu, yağ cisimcikleri ve bağ dokusu gibi diğer dokulardan dikkatlice ayırın. Ardından, yağ cisimciği kontaminasyonu olmadığından emin olmak için dokuyu taze 1X PBS tamponu ile durulayın. Orta bağırsağı, 1,5 mililitrelik bir endotüp içerisindeki 500 µL ön soğutulmuş triol reaktifine aktarın.

Ardından, yağ vücudu dokusunu pensle izole edin ve 500 µL soğutulmuş triol reajeni içeren 1,5 mL'lik bir endotüp içerisine aktarın. Son olarak, yapışmış olan tüm dokuları sıyırarak larva karkasından kütikül dokusunu izole edin. Bu işlem sırasında doku bütünlüğüne zarar vermemeye dikkat edin.

İzole edilen kütikül dokusunu taze PBS tamponu ile durulayın ve 500 µL soğutulmuş triazol reaktifi içeren 1,5 ml'lik bir ependorf tüpüne aktarın. İzole edilen yağ vücudu kütikül ve orta bağırsak dokuları, RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklanabilir. RNA ekstraksiyonu hazırlığı aşamasında, çeşitli EAB örneklerini gelişim evrelerine göre sınıflandırın.

Bu aşamalar yıldızlarda, PrepU'da ve yetişkinlerde birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü evreleri içerir. RNA ekstraksiyonuna başlamak için, öncelikle 1,5 mililitre triol içeren einor tüplerindeki dokuları plastik havan uçlarıyla homojenize edin. Homojenizasyondan sonra, her örneğin toplam hacmini triol reaktifi ile bir mililitreye tamamlayın.

Gelişim aşamaları için, tüm hayvanı sıvı azot kullanarak havan ve havan eli ile homojenize edin. Ardından, homojenize edilen örnekten bir alikot miktarını bir mililitre triol ekleyin. Örnek tüplerini bir mililitre triol ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkube edin.

İnkübasyonun ardından, kloroformu ekledikten hemen sonra her tüpe 200 µL kloroform ekleyin. Tüpleri yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ardından tüpleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika daha inkübe edin.

Ardından, örnekleri 2 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 GS'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, RNA sulu fazda yer alacaktır. Sulu fazın hacmi 600 µL veya toplam triol hacminin %60'ı olmalıdır.

Sadece sulu fazı dikkatlice alın. Sulu fazın altındaki maddelerin bulunması, ekstrakte edilen RNA'nın kontamine olmasına neden olacaktır. Ardından sulu fazı, uygun şekilde etiketlenmiş 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın.

Sulu faz karışımından RNA'yı çöktürmek için her tüpe 0,5 milliliters izopropil alkol ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından tüpleri iki derece Celsius'ta 12, 000 Gs ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, tüplerdeki S natin'i atın.

RNA, tüpün dibinde oluşan jel benzeri pelet içinde bulunmaktadır. Peleti %75 etanol ile yıkayın; vorteksleme ile karıştırarak her 1 mL için en az 1 mL %75 etanol ekleyin. Ardından tüpleri 2 °C'de, 7.500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Tüplerdeki süpernatantı dökün. Tüpleri küçük masaüstü santrifüjde bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Dikkatli pipetleme yaparak tüpte kalan fazla süpernatantı alın.

Tüpü açık bırakın ve peletin beş ila 10 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin. Peleti aşırı kurutmamaya dikkat edin, çünkü bu durum hava kurutmada sonrası çözünürlüğünü önemli ölçüde azaltacaktır. Peleti dathyl percarbonate veya dep deniz işlemi görmüş su içerisinde yeniden süspanse edin.

Peleti yeniden süspanse etmek için kullanılan su miktarı, peletin boyutuna bağlı olarak değişecektir. Küçük bir pelet için 50 µL, büyük bir pelet için ise 100 µL dep sea işlem görmüş su kullanın. Pipet ucunu birkaç kez aşağı yukarı hareket ettirerek peletin dep sea işlem görmüş su içinde tamamen çözülmesini sağlayın.

Pellet çözündükten sonra, örneği 10 dakika boyunca 55 °C'de bekletin. Ardından, her bir RNA örneğinin konsantrasyonunu bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak ölçün. Son olarak, R-T-P-C-R için Invitrogen SuperScript birinci zincir sentez sistemini kullanarak ilgili RNA örnekleri için birinci zincir cDNA sentezini gerçekleştirin.

Bu prosedür, bu protokolün yazılı bölümünde bulunabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR veya Q-R-T-P-C-R işlemine başlamak için, her primerin erime sıcaklığı 60 °C ve ürün boyutu yaklaşık 100 baz çifti olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bu deneyde ilgi alanı olan gen olarak AP par one kullanılmıştır.

Verilerin daha sonraki analizi ve normalizasyonu için bir referans gen veya iç kontrol gereklidir. Burada, referans gen olarak ribozomal protein a P RRP one kullanılır. Ardından, her bir kuyucuk için örnek adını belirten bir şablon ve QR tpcr plakası tasarlayın.

Her gen için standartlar eklemeyi ve örnek başına en az iki teknik tekrarlanan işlem yapmayı unutmayın. Ardından QRT PCR cihazını açın ve CFX 96 cihazı için plaka kurulumunu tamamlamak amacıyla döngü parametrelerini girin. İlk olarak, her kuyu için ayrı tüplerde her bir gene yönelik master mix hazırlayın.

Master mix; iki mikrolitre nükleaz içermeyen su, dört mikrolitre 2.5 x cyber green, bir mikrolitre ileri primer ve bir mikrolitre geri primerden oluşarak toplam sekiz mikrolitre hacme ulaşır. Önceden tasarlanan şablona göre, her kuyucuğa iki mikrolitre CDNA ekleyin. Ardından, her kuyucuğa sekiz mikrolitre master mix ekleyerek reaksiyon başına toplam 10 mikrolitre hacim elde edin; numunenin iyice karıştığından emin olmak için pipetle aşağı yukarı hareketler yapın.

Uçta sıvı kalmadığından emin olun. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her numune için yeni bir uç kullanın. Tüm plaka hazırlandıktan sonra, plakayı optik bantla kapatın.

Yağ kalıntılarının okumayı etkileyebileceği göz önünde bulundurularak bandın temas edilmekten kaçının. Ardından, santrifüj sonrası kuyucuklardaki tüm ürünlerin plakanın tabanında olduğundan emin olmak için plakayı 1 dakika boyunca 500 RPM hızda santrifüjleyin. Plakanın tabanında buz veya su bulunmadığını kontrol edin.

Son olarak, plakayı QR TPCR cihazına yerleştirin ve larval EAB için temsilci sonuçlar veren PCR programını çalıştırın. Diseksiyon ve QR TPCR burada gösterilmektedir. Larva EAB diseksiyonu, larvanın ortasında orta bağırsağı ortaya çıkarmalıdır.

EAB larvalarının orta bağırsağı burada gösterildiği gibi izole edilmiştir; ortalama bağıl ekspresyon değerleri veya RAV'ler. Paratrophin geni AP par one için kutikula, orta bağırsak ve yağ cisimcikleri dahil olmak üzere farklı larval dokular burada gösterilmiştir. EAB'ye özgü ribozomal protein ARP one, ilgilenilen gen için elde edilen verilerin normalizasyonu için iç kontrol olarak kullanılmıştır.

Farklı larva dokuları için AP AP par one'nin göreceli kat değişimi çıkarılmıştır. Kütikül dokusu en düşük ekspresyonu göstermiş ve bu nedenle EAB'nin birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü larva dönemleri dahil olmak üzere farklı gelişim aşamaları için AP Perry. One'ın kalibratör örnek ortalama RV'leri olarak alınmıştır.

PrepU ve yetişkin örnekleri, verileri normalize etmek için dahili kontrol olarak aprp one kullanılarak belirlenmiştir. Çeşitli gelişim aşamaları için AP Perry one'ın göreceli kat değişimi belirlenmiştir. Burada PrepU örneği en düşük mRNA seviyesini göstermiş ve bu nedenle kalibratör olarak alınmıştır.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, lateral diseksiyonların nasıl yapılacağını ve ardından Emerald ra'nın lateral bölgeleri ile çeşitli gelişim aşamaları kullanılarak kantitatif R-T-P-C-R ile gen ekspresyon analizinin nasıl yürütüleceğini göstermiş olduk. Doku örneklerinde çapraz kontaminasyon oluşmaması için diseksiyon sırasında dikkatli olmalısınız. Ayrıca, Q-R-T-P-C-R işlemi sırasında ilgili örneklerin ilgili PCR kuyucuklarına pipetlenmesi konusunda özen gösterilmelidir.

İşte bu kadar. Videomuzu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.