Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebra balığı embriyosundaki nöral hücreleri yüksek çözünürlükte görüntülemektir. İlk olarak, membran hedefli yeşil floresan protein kodlayan DNA, tek hücre aşamasındaki bir zebra balığı embriyosuna enjekte edilir; bu durum mozaik kalıtıma yol açarak dağınık hücrelerin gelişmiş şekilde görüntülenmesini sağlar. Ardından embriyolar anti-GFP ile immün olarak işaretlenir ve kesitleri alınır, böylece sabitlenmiş bir preparatta tekil hücrelerin morfolojisinin yüksek çözünürlükte görselleştirilmesi sağlanır. Alternatif olarak, hücresel dinamikleri görüntülemek amacıyla canlı embriyolar time-lapse video mikroskopisi kullanılarak incelenebilir.

Hücre morfolojisini veya dinamiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Burada, zebra balığı arka beyni konfokal mikroskopi ile görüntülenmektedir. Herkese merhaba.

Ben University of Maryland Baltimore County biyolojik bilimler bölümündeki Dr. Rachel Brewster'ın laboratuvarından PR Chandran. Bugün size, zebra balığı embriyosundaki sinir hücrelerini daha yüksek çözünürlükte işaretleme ve görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarda bu prosedürü tipik olarak, zebra balığı embriyosundaki nöronal ilişkilerin mekanizmalarını hücresel düzeyde incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Islatılmış Kimwipe'ları 100 milimetrelik bir Petri kabının kenarlarına yerleştirin.

Nemlendirilmiş kabın içindeki bir mum şeridi üzerine cam bir mikroenjeksiyon iğnesini dikkatlice sabitleyin. Bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, iğneyi dereceli bir lamla hizalayın. Uygun boyutta bir uç elde etmek için, temiz bir jilet kullanarak iğneye çapının 1 µm olduğu noktadan hafifçe vurun.

İğneyi mikroenjeksiyon cihazına bağlayın, parafilm üzerine 0,5 µL fenol kırmızısı ve su çözeltisi damlatın ve iğneyi bu damlacıklardan ön doldurma yaparak doldurun. Mikroenjeksiyon basıncını 7 kPa'ya ayarlayın ve 20 ms'lik bir pulse (darbe) ile başlayın. Tüm sıvının boşaltılması için gereken pulse sayısını sayın. Sıvının boşaltılması için yaklaşık 250 pulse gerekecek şekilde süreyi 10 ile 30 ms arasında değiştirin.

0,5 µL çözelti. Görselleştirme için fenol kırmızısı ile karıştırılmış suda MG FPD NA'dan 0,5 ila 1 µL alarak mikro pipet yardımıyla iğneyi geri doldurun. Stereo mikroskop altında çözeltinin iğneden buharlaşmasını önlemek için nemlendirilmiş kabın kapağını kapatın.

Tek hücre aşamasındaki ayrı balık embriyolarını, embryo.Medium ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Korionun nazikçe kavranması ve embriyonun stabilize edilmesi için ince pens kullanın. MGFP ve fenol kırmızısı ile doldurulmuş iğneyi, enjeksiyon için hedef bölgeye hareket ettirin.

Geniş kapsamlı MGFP ekspresyonu için sarıya veya sitoplazmaya enjeksiyon yapın. Yaklaşık iki nanolitre MGFP solüsyonu iletmek için mikroenjeksiyon cihazını kullanın. Enjeksiyonun doğru yapıldığını onaylamak için fenol kırmızısı indikatörünün konumunu gözlemleyin.

İğneyi embriyodan dikkatlice çıkarın. Kapta bulunan tüm embriyoları, tek seferde 30 embriyoya kadar enjekte edin. Embriyoların ışığa maruz kalmasını önleyin ve embriyoların stereo mikroskop altında istenen aşamaya gelene kadar gelişmeleri için 28.5 °C'de inkübe edin.

Embriyoların üzerindeki Corian'ı nazikçe soymak için ince pens kullanın. Kapta sadece kaplanmış embriyolar kalacak şekilde, boş Corian'ı uzaklaştırmak için bir pasta pipet kullanın. Enjekte edilmiş kaplı embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için ateşle cilalanmış bir pasta pipet kullanın.

Mümkün olduğunca fazla fazla besiyerini uzaklaştırın, ardından bir mililitre ative ekleyin. Embriyoları oda sıcaklığında, her biri beş dakika boyunca üç kez 1X PBS ile yıkayın. Embriyoları stereo mikroskop altında 1X PBS ile doldurulmuş bir petri kabına aktarın.

Embriyoyu kuyruk bölgesinden tutmak için ince pensler kullanın. Arka çerçeve bölgesine dokunmadan mümkün olduğunca fazla vitellüs sarkısını uzaklaştırmak için ikinci bir pens seti veya bir poker kullanın. Stereo mikroskop altında, ince pensleri kullanarak embriyoyu kapstan kaldırıp %4 düşük erime noktalı agar ile doldurulmuş bir kesit kalıbına yerleştirin.

Embriyoyu kalıbın bir ucuna doğru yerleştirin. Agarozun oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Sertleşmiş agaroz bloğunu kalıptan çıkarmak için bir spatula kullanın ve bir bistüri ucuyla bloğun alt ucunu düzgünce kesin.

Bloğu, istenirse kesik tarafı aşağı gelecek şekilde vibrato tablasına sabitlemek için bir damla hızlı yapıştırıcı kullanın. Tabla üzerinde birden fazla bloğu hizalayın. Tablayı vibratoya takın.

Bıçağın her bir embriyoyu tamamen kesecek şekilde, ancak bloğu tamamen geçmeyecek şekilde ayarlandığından emin olun. Sahneyi bir XPBS kesitiyle doldurun. Embriyoları bir arou bloğunun arkasına kadar dikkatlice kesin ve bir XPBS ile dolu bir Petri kabına aktarın.

Kesitleri stereo mikroskop altında ayırın. İstenen kesitleri, 1x PBS ile doldurulmuş çok kuyucuklu bir kaba yerleştirmek için ince pens kullanın. Her embriyo için farklı bir kuyucuk kullanın.

Kesitleri DPI ile boyayın ve anti GFP ile immün etiketleme yapın. Aksi takdirde, 48 saat içinde görüntüleme gerçekleştirin. Konfokal görüntüleme için lam başına altı kesite kadar yerleştirin ve kesitlerin üzerine bir lamel kapatın.

Fotobeyazlamayı önlemek için lamları karanlıkta saklayın. Canlı görüntüleme sırasında, MGFP enjekte edilmiş embriyolar ışıktan korunmalıdır. Embriyolar istenen gelişim aşamasına ulaşmadan 30 dakika önce kaplama işlemi için pens kullanın.

Kaplanmış embriyoları, %0,01 Trica içeren embriyo ortamından oluşan bir sedatif çözeltiye aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kalıbı dolduracak şekilde, 35 milimetrelik cam tabanlı bir kültür kabına suda çözünmüş %1'lik standart agar damlatın. Agarın katılaşmasını bekleyin.

Stereo mikroskop altında, 90 milimetrelik cam kapiler tüpü kullanarak aros damlasında üç delik açın. Kuyucuğun tabanını inceleyin ve kalan tüm aros artıklarını pens yardımıyla temizleyin. Stereo mikroskop altında kabı embriyo besiyeri ile doldurun.

Her bir embriyoyu aros üzerindeki deliklere transfer etmek için bir pasta pipeti kullanın. Embriyoyu, bu vakada ilgi alanı olan dorsal baş bölgesinin cama dayalı olacak şekilde konumlandırmak için ince pens kullanın. Kabı kapatın.

Kabı, konfokal mikroskobun tablasına dikkatlice taşıyın. Görüntüleme boyunca embriyoları 28.5 °C'de tutmak için ısıtıcılar kullanın. Burada, dört ila beş somite evresindeki vahşi tip bir embriyonun arka beyninden alınan bir kesit görülmektedir; kesit, yeşil renkte membran hedefli GFP ve mavi renkte D ile çift etiketlenmiştir. Sadece tek bir hücrenin membran bağlı GFP ile etiketlenmesi, hücresel morfoloji ve organizasyonun yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak tanır.

Bu, dört ila beş somit aşamasındaki bir nardi din mutantının arka beyninin karşılaştırmalı bir görüntüsüdür. Bu görüntü, nardi mutantlarındaki hücrelerin nöro-revelasyon sırasında orta hatta doğru düzgün şekilde yönlenemediklerini ortaya koymaktadır. Hücrelerin MGFP ile işaretleme yönteminin aksine, arka beynin beta-catenin gibi genel bir hücre yüzey belirteciyle işaretlenmesi, tekil hücrelerin morfolojisinin görselleştirilmesine olanak tanımaz.

MG FP ile işaretlenmiş bir embriyonun arka beyninin zaman geçmeli görüntülemesi, zebra balığında nöronal yerleşimi yönlendiren hücre davranışlarının oldukça dinamik olduğunu ve hücreler göç ederken ve birbirine kenetlenirken membran çıkıntılarının uzamasını içerdiğini ortaya koymaktadır. Sizlere, tek hücreli yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hem sabitlenmiş hem de canlı zebra balığı embriyolarının nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.