Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Merhaba, ben California Irvine Üniversitesi ve Ed Maki'nin Laboratuvarı'ndan Spencer Curley ve kriyoseksiyonun nasıl yapıldığını göstereceğim. Bunu yapmak için önce bu yaygın olarak kullanılan reaktifleri kullanıyorum. Kullandığım gömme bileşiği veya gömme ortamı, optimum kesme sıcaklığı için OCT olarak adlandırılır.

Berrak bir çözeltidir, çok kalın ve viskozdur ve dokuyu güzel bir şekilde tutarken onu yönlendirebilir ve sonra donar ve sonuçta suda çözünür, böylece her türlü boyama prosedürü sırasında ondan kurtulabilirsiniz. Bu yüzden dokuyu bir kalıba gömüyorum. Bu kriyo kalıp biyopsi kapları, çeşitli boyutlarda gelirler.

Burada bu küçük kalıbı kullanacağım çünkü fareden embriyonik doku yapıyorum. Mendilimizi ve sıvı azotumuzu hızlı bir şekilde donduruyoruz. Bu yüzden önce bu koruyucu termosu tankımızdan aldığımız sıvı nitrojenle dolduracağım.

Dokuyu flaş dondurmadan önce, dokuyu korumak için kriyo denilen şeyi yapmanız gerekir, aksi takdirde dondurmanın kendisi dokuyu tahrip eder. Yani yaptığınız şey, dokuyu gece boyunca %30'luk bir sükroz çözeltisine batırmaktır. Ve eğer daha uzun sürerse, sorun değil, doku battığı sürece.

Ve gördüğünüz gibi, vize embriyonik gün 12.5 fare kafası, sakaroz çözeltisine batırılmış, bu yüzden dondurulmaya hazırlar. Şimdi sakaroz solüsyonundaki dokuyu daha büyük bir tabağa dökeceğim, böylece dokuyu manipüle edebilirim. Bu OCT'nin bir kısmını alacağım ve aslında kapağında duran bu 35 milimetrelik tabağa dökeceğim, böylece onu bir açıyla elde edebilirim.

Böylece OCT derinlik için kenar boyunca toplanır. Bu yüzden bir çift eski körelmiş forseps kullanıyorum çünkü keskin olmalarına gerek yok ve başka bir forseps çiftini mahvetmek istemiyorsunuz. Ben de onları alıyorum ve bu kafalardan birini çok nazikçe kaldırıyorum ve onu bu ilk Ekim banyosuna yerleştiriyorum.

Sadece embriyoyu OCT'de kaplamak istiyorum. Bu, dokunun daha iyi, daha homojen bir şekilde dondurulmasını sağlar. Doku çevresinde herhangi bir kalıntı sakaroz veya herhangi bir hava kabarcığı istemezsiniz.

Kesinlikle hava kabarcıklarından kaçının. Bu yüzden OCT'yi başın etrafında ve altında nazikçe karıştırıyorum, kafayı OCT'den geçiriyorum ve kriyo kalıbımı doldururken sadece birkaç saniye orada kalmasına izin veriyorum. Şimdi kriyo kalıbını tekrar OCT ile dolduracağım, baloncuklardan kaçınarak.

Ve ben sadece kalıbın tepesine kadar dolduracağım. Ve fark edeceğiniz gibi, kalıbı etiketledim. Bu yüzden yapacağım, donduktan sonra yönümü görebileceğim.

OCT donduğunda beyaza döner ve dokunuzu artık göremezsiniz. Bu yüzden kesinlikle kalıcı bir işaretleyici ile etiketlemek istersiniz. Kriyo kalıbı.

Aslında OCT'de bir baloncuk oluştu, bu yüzden forsepsimi onu kenardan dışarı itmek için kullanacağım. Bunun sizin dokunuza müdahale etmesini istemezsiniz, dokunuzun donmasıyla. Bu yüzden şimdi bu yemeğin kafasını kalıbımdaki OCT'ye aktaracağım.

Sadece tabaktan kaldıracağım ve çok nazikçe kalıba yerleştireceğim. Sonra dokuyu yönlendireceğim mikroskoba gideceğim. Burada kriyo kalıbımdaki doku var ve onu yönlendirebilmek için dürbüne bakacağım.

Bu fare kafası aracılığıyla koronal bölümler yapacağım. Bu yüzden, koronal bölümler için kriyostatta konumlandırabilmem için onu yönlendirmem gerekiyor. Yine, bu eski körelmiş forsepsleri kullanıyorum ve gördüğünüz gibi, burada bazı baloncuklar var ve onları çıkarmak için elimden gelenin en iyisini yapacağım.

Ama bu küçük baloncuklar kötü değil, kötü değil. Bu küçük baloncuklarla ilgili hiçbir şey fark etmedim. Sadece büyük baloncuklar istemiyorsun.

Bu yüzden onları elimden geldiğince temizleyeceğim ve forsepsleri kesinlikle sık sık sileceğim çünkü bu şekilde baloncukları daha iyi önleyebilirsiniz. Ve şimdi etiketlememi görüyorsanız, burada üstte bir t ve solumda bir F var. Bu bana sadece başın, başın üst kısmının yukarıda olacağını ve ön tarafın veya yüzün solumda olacağını gösteriyor.

Bu şekilde koronal kesitler için hangi yüzeyden geçeceğimi biliyorum ve sadece dokuyu dürtüyorum. Ve yine, bazen bu kabarcıkları ortaya çıkarır ve onları sadece dokuyla birlikte donmamaları için dışarı itmek istersiniz. Bu yüzden baloncuklara sahip olmak kötüdür, çünkü donarken, doku kabarcıkları sizi tutarsız bir şekilde dondurmaya neden olabilir.

Hızlı dondurmanın amacı, her şeyin bir kerede donmasıdır. Ayrıca, dokuyu ve kriyostatı keserken, bıçak OCT veya doku yerine bir baloncuğun içinden geçerse, bir takılmaya veya yırtılmaya neden olabilir ve dokuyu yok edebilir veya bilirsiniz, kırabilir. Bu nedenle, ne pahasına olursa olsun bu baloncuklardan kesinlikle kaçınmak istersiniz.

Özellikle daha büyük olanlar. Bu yüzden hala buraya yönlendiriyorum. Bu doku 24 saattir sabitlendi, bu yüzden manipülasyonlarıma karşı oldukça sağlam.

Diğer dokular biraz daha yumuşak olabilir, bu yüzden sadece çok nazik olmak istersiniz. Bu yüzden, yüzü sola ve başın üst kısmı yukarı bakacak şekilde dürbünün altına yerleştirdikten sonra, diğer yönlendirme düzlemlerinde de doğru olduğundan emin olmam gerekecek. Bu yüzden küpü kaldıracağım ve doğru olduğundan emin olmak için küpün tüm yüzlerine bakacağım.

Ve hafifçe aşağı açılı olduğunu görüyorum, bu yüzden sadece forsepslerimle kaldırmam gerekiyor. Tamam? Ve bu kesinlikle çok fazla pratik gerektirir. Tamam, iyi görünüyor.

Şimdi buraya yürüyeceğim ve onu sıvı nitrojen içinde donduracağım. Tamam, şimdi doku kriyo kalıbına düzgün bir şekilde yönlendirildiğine göre, sıvı nitrojenimi buradaki bu tabağa dökeceğim. Bu, doku kültürü için en üste kadar normal bir plastik Petri kabıdır.

Oldukça hızlı bir şekilde buharlaşır. Forsepsimi alacağım ve kriyo kalıbını indireceğim. Ve gördüğünüz gibi, aslında alt dudağımı büktüm.

Bu kesinlikle daha iyi, daha iyi yol tutuşu sağlar. Onu donduracağım. Doku ve OCT dondukça, katı beyaza döner.

Ve tamamlandığında, hepsi beyaz olacak. Ve sonra donmuş dokuyu saklamak için eksi 80 dondurucuya hızlı bir şekilde yerleştirmem gerekiyor. Onu, doku suya batmayacak şekilde tutmak istersiniz.

Bu yüzden onu sıvı nitrojenin üst yüzeyinde tutmak için çok dikkatli olmalısınız. Tamam, şimdi dondu. Eksi 80'e gitmeden önce birkaç saniye daha orada tutun.

Tamam, şimdi eksi 80'e götüreceğim. Bu yüzden dokumu eksi 80'den aldım ve buradaki kriyostatın içine yerleştirdim. Oda aslında eksi 24 santigrat dereceye kadar düşüyor.

Şu anda, kesitlere başlamadan önce dokunun yaklaşık yarım saat ila bir saat arasında dengelenmesine izin vermelisiniz. Aksi takdirde, çok kırılgandır. Bu nedenle, tüm kriyo istatistikleri farklı olsa da, burada bu makineyle ilgili bazı temel şeylere dikkat çekeceğim.

Bu yüzden Leica CM 30 50 s kullanıyoruz. İyi bir makinedir çünkü numunenin kendisi için ayrı bir soğutma ünitesine sahiptir, bu da güzel bir ek avantajdır. Numune sıcaklığını ayarlayabilirsiniz ve farklı dokular kesim için farklı sıcaklıklar gerektirir.

Bu nedenle, dokunuzu ilk yüklediğinizde, birkaç ayarlama yapmanız gerekir. Ve bunlar tüm kriyo istatistiklerinde benzerdir. Bunlar elektronik, bazıları elle çalıştırılıyor.

Örneğin, kriyostatın kolunu geri çekmeniz veya bıçağa daha uzak veya daha yakın konumlandırmak için ilerletmeniz gerekir. Bunu hızlı veya yavaş yapabilirsiniz. Kesiminizin kalınlığını burada artı veya eksi ile ayarlayabilirsiniz.

Ve burada orta düğmede belirtilen döşeme veya kesit kalınlığı arasında seçim yapacaksınız. Odanın veya numunenin sıcaklığını, bu dijital ekranın yanında, sadece buna basarak ve sıcaklığı ayarlamak için bu yukarı veya aşağı okları kullanarak ayarlayacaksınız. Bu nedenle, bizim için, kriyoseksiyon yaptığımızda, bu balık balıkçısı marka Süper donlar ve mikroskop slaytları kullanıyoruz.

İşlem sırasında dokunun çıkmaması için bir miktar yapıştırıcı ile kaplanırlar. Bazen kesit sırasında dokunun biraz yumuşak göründüğünü fark edeceksiniz ve bunun bazı belirtileri bıçağa çarpıp topaklanıp toplanmadığı şeklinde olacaktır. Ve bunu düzeltmek için kullanabileceğiniz şey, bu Fisher marka süper dostu dondurmadır.

Bu, bu, dokuyu dondurur ve siz sadece dokunuza doğrultun ve tetiğe basın ve çok yumuşaksa dokuyu hızla yeniden dondurun. Mendili kesit almak için bir aynaya monte etmeden önce, sizi burada makinedeki bazı şeyler hakkında hızlı bir tura çıkarmak istiyorum. İşte bu metal plaka ile sabitlenmiş olan bıçağı gerçekten yüklediğiniz yerdir.

Bu kolu yukarı çekerek, bıçağı gerektiği gibi çıkarabilir ve değiştirebilirsiniz. Güzel ve güvenli olduğundan emin olun. Bıçağı aşırı sabitlemek istemezsiniz, aksi takdirde gerçekten bükülür.

Ve kesitinizde doku kalınlığının tutarlı olmadığını, tutarlı olmadığını fark edeceksiniz. Yani istiyorsun, bu kolu tamamen aşağı itmek istemiyorsun. Onu sadece bıçağın kendisiyle bile, olduğu yere getirmek istersiniz.

Bu, bölümlere ayırma sırasında ayarlamanız gerekebilecek başka bir şeydir. Buna viraj önleyici plaka denir. Buradaki tutucuya uyan bir cam parçası ve buradaki yaylı vidayı kullanarak ayarlayabilirsiniz.

Ve temelde onu ileri veya geri hareket ettirirsiniz. Ve bu, dokunuzu veya bölümlerinizi düz tutacak, böylece onları bir slayta monte edebileceksiniz. Kesitleme sırasında ayarlamak isteyebileceğiniz bir diğer şey de bıçağın asıl kesimi yapan yeridir.

Peki bunu nasıl ayarlarsınız, yani sadece bu kolu kaldırırsınız ve tüm bu mekanizmayı sola veya sağa kaydırabilirsiniz. Ve bunu yalnızca dokunuzun bıçağın belirli bir kısmına takıldığını fark ederseniz veya bıçakları kurtarmak istediğinizde kullanırsınız çünkü oldukça pahalıdırlar. Yani sadece bunu ileri geri hareket ettirerek güzel ve temiz bir alan bulabilirsiniz.

Ayarlayabileceğiniz başka bir şey de kesme açısıdır. Şimdi burada, sizin göremeyeceğiniz tarafta, üç farklı pozisyon var. Biz sadece orta pozisyonu kullanıyoruz ve siz bunu diğer kolu kaldırarak ayarlıyorsunuz.

Ve bu olabilir, bu mekanizmayı yukarı ve aşağı hareket ettirebilirsiniz. Her zaman ortada tutuyoruz. Bu yüzden şimdi bunu devam ettireceğim.

İşte bu arkada, kriyostatın başı var. Aslında donmuş doku örneğini kesitlere ayrılırken tutacaktır. Yukarı ve aşağı sallanır ve bıçağa doğru ilerler.

Ve temel olarak mendili bu aynanın üzerine monte ediyorsunuz ve biz de aynayı kafanın içine yerleştireceğiz, sıkacağız ve sonra bu arkadaki düğmeleri kullanarak açıyı ayarlayarak daha düz bir kesim elde edeceğiz. Şimdi dokuyu aynanın üzerine monte edeceğim. Mandrenleri oda sıcaklığında tutmak istiyorsunuz çünkü önce bir OCT tabakası ekleyeceksiniz ve bunun hemen donmasını istemiyorsunuz çünkü güzel bir düz tabaka olmasını istiyorsunuz.

Ve bu mekanizmayı burada bir ısı aspiratörü için kullanacağız. Aslında, donarken OCT'yi düzleştirmek için kullanılacak. Bu yüzden ilk yaptığım şey, oda sıcaklığını kontrol etmek ve buradaki tutucuya yerleştirmek.

OCT baloncuklarımdan bazılarını al. Burada önemli değil çünkü sıkılacaklar. Sadece birazcık ekleyin, çok fazla ihtiyacınız yok.

Isı aspiratörünü alın ve hemen oraya oturtun. Birkaç saniye bekleyin. Ve sonra orada OCT'nin güzel ve düz olduğunu görebilirsiniz.

Şimdi dokumu aldım ve gerçek OCT'yi işaretlemem gerekiyor. Tamam, bu yüzden konumunu belirtmek için OCT üzerinde bir noktayı işaretleyeceğim. İşte orada, üst kısmı mavi bir nokta ile işaretledim.

Şimdi doku bloğunu kalıptan çıkaracağım ve bunu sadece arkasına doğru iterek yapacağım. Bu yüzden yavaşça sırtını iteceğim ve sadece elime iteceğim, ama yine de çözülmesini istemiyorum. Bu yüzden hemen yerine koydum.

Şimdi gördüğünüz gibi, üzerine koyduğum mavi işaretli doku bloğu. Bu yüzden embriyonun başının üst kısmı olduğunu biliyorum. Ve yüzü kesitlere ayırmak istiyorum çünkü bunlar koronal kesitler.

Şimdi yapacağım şey, bir damla daha OCTA büyük damlacık ekleyeceğim ve şimdi hızlı hareket etmem gerekiyor çünkü her şey soğuk. Ve mendilimi alacağım ve tam ortasına yerleştireceğim, zaten yapılmış olan OCT yatağına karşı düz olduğundan emin olacağım. Şimdi bunun donmasına izin vereceğim ve bu yaklaşık bir veya iki dakika sürecek.

Yani şimdi donma bitti. Ve ben, aynanın üzerine monte edilmiş mendili alacağım, kafaya yerleştireceğim, mümkün olduğunca düz hale getireceğim, ve sonra sıkacağım. Olabilir, güzel ve sıkı.

Bıçağın hemen önüne yerleştireceğim ve sonra ilerleteceğim, bu birkaç saniye sürebilir. Tamam, şimdi bıçağın düz kenarını dokuyu gerçekten hassas bir şekilde konumlandırmak için kullanacağım. Bu yüzden basitçe, yapacağım, kenara bakacağım ve kenarların aynı hizada olduğundan emin olmak için dokuyu yukarı ve aşağı sallayacağım.

Eğer yapmadılarsa, bilirsiniz, böyle bir şeye benzeyebilirdi. Açıkçası abartıyorum, ama burada gördüğünüz gibi, bu, doğrudan bıçağa karşı değil. Bu yüzden, alabileceğim kadar düz olduğunu hissedene kadar ayarlamalar yapmaya devam ediyorum.

Bence bu oldukça iyi. Bu yüzden, dokunun bıçağa doğru düz bir şekilde kesileceğinden emin olmak için her açıdan bakıyorum ve bunu belirtmek için bıçağın kenarını kullanıyorum. Yukarıdan bakıyorum ve yandan bakıyorum ve doku aslında oldukça iyi görünüyor.

Çok fazla ayar yapmam gerekmiyor ama yapsaydım sadece kafanın arkasındaki düğmeleri kullanırdım. Ve bunları sola veya sağa çevirerek, bu şekilde ince ayarlar yapabileceğinizi görebilirsiniz. Ama oldukça iyi görünüyor.

Şimdi, ben, aslında dokuyu ilerletiyorum. Henüz kesmiyor çünkü bıçağa karşı değil. Doku, OCT'nin derinliklerine gömülüdür.

Bu yüzden dokuya ulaşmak birkaç dakika sürebilir. Çok hızlı gitmek istemezsiniz çünkü OCT'yi ve dokunuzu yakalayıp kırabilir, ancak aynı zamanda çok yavaş gitmek de istemezsiniz çünkü sonsuza kadar sürebilir. Bu makinede, daha kalın bir bölümde düzeltme yapabileceğiniz ve daha hızlı gitmenizi sağlayacak güzel bir işlev var.

Yani şimdi aslında, şimdi OCT'yi kesiyorum, bu yüzden biraz yavaşlıyorum. Bu yüzden henüz dokuya ulaşamadım, ancak bu, kesitin nasıl gideceğini değerlendirdiğim zamandır. Pek çok değişken, doku kesitinizin gerçekten iyi veya gerçekten kötü gitmesine neden olabilir, olabilir.

Bu kriyostatta en sık bulduğum şey, dokunun aslında biraz fazla soğuk olması. Yaptım, sıcaklığı düşürdüm ama yine de biraz fazla soğuk gibi görünüyor. Ve olan şu ki, bıçak doku boyunca, doku boyunca veya OCT boyunca gevezelik edecek.

Yani bu küçük çizgileri, bu yatay çizgileri OCT boyunca elde edeceksiniz. Yaptığım şey, baş parmağımı alacağım ve sadece kenarını ısıtacağım, OCT'yi sadece hafifçe dokunarak, baş parmağımı kaydırarak ısıtacağım, çok uzun süre değil. Ve sonra onu bölümlere ayırdığımda, çok daha iyi çıktıklarını ve gevezeliğin durduğunu fark ettim.

İşte bunlar, dokuya ulaşmadan önce değerlendireceğim, değerlendireceğim türden şeyler. Bu yüzden, bıçak dokudan geçerken, aslında OKT'de bir takılma veya çatlak olduğunu fark ettim. Bu yüzden ilk yaptığım şeylerden biri bıçağı değiştirmek.

Bu bıçağın ne kadar süredir burada olduğundan ve benden önce kimin kullandığından emin değilim, bu yüzden devam edip yeni bir bıçak çıkaracağım. Bunlar açıkçası çok keskin, bu yüzden dikkatli olmalısınız. Bu yüzden viraj önleyici plakayı ayarlayacağım ve burada alt kısımda vidalı yaylı bir vida var, sadece altına ulaşmanız gerekiyor ve onu içeri veya dışarı hareket ettirebilirsiniz.

Bu yüzden yeterince ilerledim ve bölümlere ayırdım, böylece şimdi dokunun içindeyim. Ve ne yazık ki, OCT bloğunda bir çatlak var, bu sık sık oluyor ve ne yazık ki bunu gerçekten kontrol edemiyorsunuz, ancak düzeltmek için yapabileceğiniz şeyler var. Çatlak dokudan geçmişse, numuneyi atmanız veya elinizden geleni kurtarmaya çalışmanız gerekir.

Bu durumda, çatlak dokunun üzerinde gibi görünmektedir. Şimdi yapacağım şey, kriyostatın içinde olan bir tıraş bıçağını almak. Bu, soğutulmuş.

Ve ben sadece OCT bloğunun üst kısmında bulunan çatlak kısmı kesmeye çalışacağım. Yani yine, OCT bloğunun yüzünü ısıtmak için baş parmağımı kullanacağım. Ve sonra kesitlere geçeceğim, ve eğer burada görebiliyorsanız, çatlamış.

Bu yüzden orada mendille birlikte parçayı çıkardım ve sonra az önce fırlattığım oct OCT'nin geri kalanı, çatlak kısımdı. Şimdi yapacağım şey, soğutulmuş bir tıraş bıçağı kullanarak o çatlak kısmı kesmeye çalışacağım. Çok düz bir şekilde girmem gerekiyor ve her iki elimi de kullanmam ve bıçağa eşit şekilde baskı uygulamam gerekiyor.

Ve bıçağı OCT'ye ileri geri sallayacağım. Bu yüzden ileri geri sallanıyorum, yavaşça OCT'yi kesiyorum. Umarım çatlak kısmı çıkarıyorumdur.

Tamam, bu fazlalığı ortadan kaldırarak azaltacağım EKİM. Tamam, iyi görünüyor. Daha sonra kafayı hafifçe geri çekeceğim çünkü bıçağa takılabilecek kenarlar oluşturdum ve bu olursa, aslında OCT'yi ve dokuyu kırabilir ve bu da numunemi mahvedebilir.

Bu yüzden geri çekildim, bu yüzden dokuya geri dönmek için biraz daha ilerlemem gerekecek ve umarım çatlağı düzeltmişimdir. Tamam, şimdi dokuya geri dönüyorum. Tamam, görünüşe göre düzelttim.

Yani artık OCT'de bölümleri yakalamayı çok daha kolay hale getirecek herhangi bir çatlak yok. Şimdi dokunun ilgi duyduğum kısmına geçeceğim. Şu anda, ben, daha yeni yüzeye çıkıyorum ve bu embriyonun beynine girmek istiyorum.

Bunlar, ilgi duyduğum yapıları gerçekten görebileceğim kadar büyük. Bu fırçaları, yakalayacağım her bölüm arasındaki bıçağı temizlemek için kullandığımdan bahsetmedim. Bu büyük olan sadece alanı temizlemek ve fazla ooc OCT'yi çıkarmak içindir.

Ayrıca bu daha ince fırçaları, kesiti bu soğuk plakaya karşı manipüle etmek ve onu kesit üzerinde yakalarken konumlandırmak için kullanıyorum. Yine bunlar soğuk tutulur, böylece OCT erimez ve fırçalara yapışmaz. Bu yüzden dokuyu yakalamak için önce OCT'yi ve dokuyu baş parmağımla ısıtacağım.

Ve daha önce etiketlediğim bu slaytlardan birini alacağım. Baş aşağı tutuyorum ve herkes bunu farklı şekilde yapıyor. Ama bunu yapma şeklim, kaydırak aşağı bakarken sağ elimle bu sağ üst köşeyi tutmayı seviyorum.

Ve sonra sol baş parmağımı pivot noktası olarak kullanıyorum, böylece doğrudan plakaya doğru inebilir ve bölümü yakalayabilirim. OCT ve doku aslında slayta karşı eriyecek ve kendini monte edecektir. Bu yüzden önce mendili baş parmağımla yavaşça ısıtacağım, slaytımı tutacağım, sağ elimle sağ köşeyi tutacağım, plakayı hareket ettireceğim, dümdüz aşağı indireceğim, erimesine izin vereceğim.

Kıvrım veya kabarcık olmadığından ve iyi göründüğünden emin olmak için dokuya bakacağım. Ve tüm beyni bölümlere ayırana kadar bunu yapmaya devam edeceğim. Şimdi bölümlere diseksiyon kapsamı aracılığıyla bakıyorum, iyi göründüklerinden emin olmak için ve öyle olduklarından, bölümün üst kısmında ön beyni görebilirsiniz ve hepsi çok güzel görünüyor.

Bu kriyo bölümlerini yerinde hibridizasyon gibi şeyler için kullanabilirsiniz. Bazen temel histoloji, h ve e boyaları yapıyoruz. Ayrıca immünofloresan da yapabilirsiniz ve bilirsiniz, bunun gibi bir dizi tahlil.

Özellikle benim için bu bölümler yerinde hibridizasyon için sabitlendi ve işlendi. Bu yüzden bundan sonra yapacağım şey bu.