Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Irvine kampüsünden ve Ed Maki Laboratuvarı'ndan Spencer Curley; size kriyoseksiyonlama işleminin nasıl yapılacağını göstereceğim. Bunun için öncelikle yaygın olarak kullanılan şu reaktifleri kullanıyorum. Kullandığım gömme bileşiği veya gömme ortamı, optimal kesme sıcaklığı anlamına gelen OCT'dir.

Berrak, oldukça yoğun ve viskoz bir çözeltidir; dokuyu yönlendirmeniz sırasında iyi bir şekilde tutar ve ardından donar; nihayetinde suda çözünür olduğu için her türlü boyama prosedürü sırasında kolayca uzaklaştırılabilir. Dokuyu bir kalıba gömüyorum. Bu kriyokalıp biyopsi kapları çeşitli boyutlarda bulunmaktadır.

Fare embriyonik dokusu çalıştığım için burada daha küçük olan bu kalıbı kullanacağım. Dokularımızı sıvı azot ile şok donduruyoruz. Bu yüzden önce, koruyucu vakumlu matrayı buradaki tankımızdan aldığım sıvı azot ile dolduracağım.

Dokuyu şok dondurmadan önce, dokunun kriyoproteksiyonu adı verilen işlemi gerçekleştirmeniz gerekir; aksi takdirde dondurma işleminin kendisi dokuya zarar verecektir. Bunun için dokuyu gece boyunca %30'luk bir sükroz çözeltisine batırın. Eğer bu işlem daha uzun sürerse sorun değil, yeter ki doku dibe çöksün.

Gördüğünüz gibi, embriyonik 12.5. gün fare başları sukroz çözeltisinin içine çökmüştür, yani dondurulmaya hazırdırlar. Şimdi, dokuyu manipüle edebilmek için sukroz çözeltisi içindeki dokuyu daha büyük bir kaba boşaltacağım. Biraz OCT alıp, açılı bir şekilde tutabilmek için kapağı üzerinde duran bu 35 milimetrelik kaba dökeceğim.

Böylece OCT, derinlik sağlamak için kenarlarda birikir. Körelmiş eski bir forseps çifti kullanıyorum; çünkü bunların keskin olmasına gerek yoktur ve başka bir forseps çiftini bozmak istemezsiniz. Forsepsleri alıp bu başlardan birini çok nazikçe kaldırıyorum ve onu ilk OCT banyosuna yerleştiriyorum.

Sadece embriyoyu OCT ile kaplamak istiyorum. Bu, dokunun daha iyi ve daha homojen şekilde dondurulmasını sağlar. Dokunun etrafında herhangi bir kalıntı sükroz veya hava kabarcığı kalmasını istemezsiniz.

Hava kabarcıklarından kesinlikle kaçının. Bu yüzden, OCT'yi başın etrafında ve altında nazikçe karıştırıyorum, başı OCT içinde hareket ettiriyorum ve kriyokalıbı doldururken birkaç saniye orada bekletiyorum. Şimdi kriyokalıbı, yine hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek, OCT ile dolduracağım.

Ve kalıbı tamamen, en üstüne kadar dolduracağım. Fark edeceğiniz üzere, kalıbı etiketledim. Böylece dondurulduktan sonra yönünü görebileceğim.

OCT donduğunda beyazlaşır ve dokunuzu artık göremezsiniz. Bu nedenle, kriyomikalybı mutlaka kalıcı bir markörle etiketlemek istersiniz.

Aslında OCT'de bir hava kabarcığı oluştu, bu yüzden pensetimi kullanarak onu kenardan dışarı iteceğim. Bunun dokunuzun dondurulma işlemini engellemesini istemezsiniz. Şimdi başı bu kapta bulunurken kalıbımdaki OCT'ye aktaracağım.

Dokuyu kapttan çıkarıp çok nazik bir şekilde kalıba yerleştireceğim. Ardından, dokuyu yönlendirmek için mikroskoba geçeceğim. Dokuyu burada kriyokalıbıma yerleştirdim ve yönlendirmesini yapabilmek için mikroskop altında inceleyeceğim.

Bu fare başından koronal kesitler alacağım. Bu nedenle, koronal kesitler için kriyostatta konumlandırabilmek amacıyla başı uygun şekilde yönlendirmem gerekiyor. Tekrar belirtmek gerekirse, bu küt uçlu pensleri kullanıyorum ve gördüğünüz üzere burada bazı hava kabarcıkları var; bunları çıkarmak için elimden geleni yapacağım.

Ancak bu daha küçük kabarcıklar kötü değildir. Bu küçük kabarcıkların herhangi bir etkisini fark etmedim. Sadece büyük kabarcıklar oluşmasını istemezsiniz.

Bu yüzden onları elimden geldiğince dışarı kaydıracağım ve kabarcıkları daha iyi önleyebilmek için forsepsleri kesinlikle sık sık sileceğim. Şimdi etiketlememe bakarsanız, üst kısma bir T ve sol tarafıma bir F koydum. Bu, başın üst kısmının yukarıya, ön kısmının veya yüzün ise soluma geleceğini bana gösterir.

Bu sayede koronal kesitler için hangi yüzeyden kesit alacağımı biliyorum ve dokuyu sadece hafifçe itiyorum. Ayrıca, bu işlem bazen hava kabarcıkları oluşturur ve bu kabarcıkların dokuyla birlikte donmaması için onları dışarı itmek istersiniz. Hava kabarcıklarının olması kötüdür, çünkü dondurma işlemi sırasında dokudaki kabarcıklar tutarsız bir donmaya neden olabilir.

Şok dondurmanın amacı, her şeyin aynı anda donmasını sağlamaktır. Ayrıca, dokuyu kriyostat ile keserken, bıçak OCT veya doku yerine bir hava kabarcığının üzerinden geçerse, bu durum takılmaya veya yırtılmaya yol açarak dokunuzu tahrip edebilir veya parçalayabilir. Bu nedenle, bu kabarcıklardan ne pahasına olursa olsun kaçınmalısınız.

Özellikle daha büyük olanlar. Bu yüzden hâlâ burada yönlendiriyorum. Bu doku 24 saat boyunca fikse edildi, bu nedenle manipülasyonlarıma karşı oldukça dayanıklı.

Diğer dokular biraz daha yumuşak olabilir, bu nedenle çok nazik olmanız gerekir. Dokuyu, yüzü sola ve başın üst kısmı yukarıya bakacak şekilde mikroskobun altına yerleştirdikten sonra, diğer yönelim düzlemlerinde de doğru olduğundan emin olmam gerekecek. Bu yüzden, doğruluğunu kontrol etmek için küpün tüm yüzlerine bakmak üzere onu kaldıracağım.

Hafifçe aşağı doğru eğimli olduğunu görüyorum, bu yüzden pensle sadece yukarı kaldırmam gerekiyor. Tamam mı? Ve bu kesinlikle çok fazla pratik gerektiriyor. Tamam, güzel görünüyor.

Şimdi buraya geçip örneği sıvı azot içinde donduracağım. Tamam, doku kriyokalıba düzgün bir şekilde yerleştirildiğine göre, sıvı azotu buradaki kaba dökeceğim. Bu, sadece doku kültürü için kullanılan normal bir plastik Petri kabıdır ve ağzına kadar dolduracağım.

Oldukça hızlı buharlaşıyor. Pensimi alıp kriyomukalı aşağı indireceğim. Gördüğünüz gibi, alt dudağı aslında büktüm.

Bu kesinlikle daha iyi bir işlem yapma imkanı sağlıyor. Şimdi donduracağım. Doku ve OCT dondukça, katı beyaz bir renge dönüşür.

İşlem tamamlandığında, tamamı beyaz olacaktır. Ardından, dondurulmuş dokuyu saklamak için hızlıca -80 °C dondurucuya yerleştirmem gerekir. Dokunun tamamen batmayacağı şekilde tutmanız gerekir.

Bu nedenle, örneği sadece sıvı azotun üst yüzeyinde tutmaya çok dikkat etmelisiniz. Tamam, şimdi dondu. -80'e geçmeden önce örneği orada birkaç saniye daha tutun.

Tamam, şimdi onu -80'e götüreceğim. Dokumu -80'den aldım ve buradaki kriyostatın içine yerleştirdim. Hazne aslında -24 °C'ye kadar düşmüş durumda.

Şu anda, kesit almaya başlamadan önce dokunun yaklaşık yarım saat ile bir saat arası dengelenmesine izin vermeniz gerekir. Aksi takdirde, doku çok kırılgan olur. Tüm kriyostatlar farklı olsa da, burada bulunan bu makineyle ilgili bazı temel noktaları belirteceğim.

Bu nedenle Leica CM 30 50 s kullanıyoruz. Numunenin kendisi için ayrı bir soğutma ünitesine sahip olması, onu oldukça avantajlı ve iyi bir cihaz kılıyor. Numune sıcaklığını ayarlayabilirsiniz; zira farklı dokuların kesimi için farklı sıcaklıklar gerekmektedir.

Dokunuzu ilk kez yüklediğinizde, birkaç ayarlama yapmanız gerekir. Bunlar tüm kriyostatlarda benzerdir. Bazıları elektronik, bazıları ise manuel olarak çalıştırılır.

Örneğin, kriyostat kolunu bıçağa daha uzak veya daha yakın bir konuma getirmek için geri çekmeniz veya ilerletmeniz gerekecektir. Bunu hızlı veya yavaş bir şekilde yapabilirsiniz. Kesim kalınlığını buradaki artı veya eksi butonlarıyla ayarlayabilirsiniz.

Buradaki orta düğmede belirtildiği üzere, kırpma veya kesit kalınlığı arasından seçim yapacaksınız. Dijital ekranın yanındaki bu düğmeye basıp yukarı veya aşağı oklarını kullanarak oda veya örneğin sıcaklığını ayarlayabilirsiniz. Biz kriyoseksiyon işlemi yaparken, Fisher marka Superfrost Plus mikroskop lamları kullanıyoruz.

İşleme sırasında dokunun ayrılmaması için bunlar bazı yapıştırıcılarla kaplanmıştır. Bazen kesit alma sırasında dokunun biraz yumuşak olduğunu fark edebilirsiniz; bunun belirtilerinden biri de dokunun bıçağa çarpması ve toplanmasıdır. Bunu düzeltmek için Fisher marka süper dostu dondurucuyu kullanabilirsiniz.

Cihaz, dokuyu şok dondurur; dokuya yöneltip tetiğe bastığınızda, eğer doku çok yumuşaksa hızla yeniden donduracaktır. Dokuyu kesit alma işlemi için tutucuya monte etmeden önce, makinedeki bazı bölümleri size kısaca tanıtmak istiyorum. Burası, metal plaka ile sabitlenen bıçağı yerleştirdiğiniz kısımdır.

Bu kolu yukarı çekerek, ihtiyaç duyduğunuzda bıçağı çıkarabilir ve değiştirebilirsiniz. Bıçağın iyice sabitlendiğinden emin olun. Bıçağı aşırı sıkmamaya dikkat edin, aksi takdirde bıçakta eğilmeler meydana gelir.

Kesit alma işleminiz sırasında doku kalınlığının tutarlı olmadığını fark edeceksiniz. Bu nedenle, bu kolu tamamen aşağı itmek istemezsiniz; kolu bıçağın kendisiyle yaklaşık olarak aynı hizaya getirmek istersiniz.

Burada, kesit alma sırasında ayarlamanız gerekebilecek başka bir parça daha bulunmaktadır. Buna anti-roll plakası denir. Bu, buradaki tutucuya yerleştirilen bir cam parçasıdır ve buradaki yaylı vidayı kullanarak ayarlayabilirsiniz.

Temel olarak bunu ileri veya geri hareket ettirirsiniz. Bu işlem, dokunuzun veya kesitlerinizin düz kalmasını sağlayarak onları bir lama monte edebilmenize olanak tanır. Kesit alma sırasında ayarlamak isteyebileceğiniz bir diğer husus da, bıçağın asıl kesme işlemini gerçekleştiren kısmının konumudur.

Peki, bunu nasıl ayarlarsınız? Sadece bu kolu kaldırarak tüm düzeneği sola veya sağa kaydırabilirsiniz. Bunu yalnızca dokunuzun bıçağın belirli bir kısmına takıldığını fark ettiğinizde veya bıçaklar oldukça pahalı olduğu için onları tasarruflu kullanmak istediğinizde kullanırsınız. Böylece, düzeneği ileri geri hareket ettirerek temiz bir alan bulabilirsiniz.

Ayarlayabileceğiniz bir diğer konu da kesim açısıdır. Şu an burada, göremeyeceğiniz yan kısımda, üç farklı konum bulunmaktadır. Biz sadece orta konumu kullanıyoruz ve bunu diğer kolu kaldırarak ayarlıyorsunuz.

Ve bu düzeneği yukarı ve aşağı hareket ettirebilirsiniz. Biz bunu her zaman ortada tutarız. Bu yüzden ben şu an bu konumda tutacağım.

İşte buradaki arka kısım, kriyostatın başlığıdır. Kesim işlemi sırasında dondurulmuş doku örneğini burada tutar. Yukarı ve aşağı hareket ederek bıçağa doğru ilerler.

Temel olarak dokuyu buradaki mandrene monte ediyorsunuz; mandreni başlığın içine yerleştirip sıktıktan sonra, daha düz bir kesim elde etmek için açıyı ayarlamak amacıyla arkadaki bu düğmeleri kullanacağız. Şimdi dokuyu mandrene monte edeceğim. Mandrenleri oda sıcaklığında tutmalısınız çünkü önce bir kat OCT ekleyeceksiniz ve bunun hemen donmasını istemezsiniz; düzgün ve pürüzsüz bir katman oluşmasını istersiniz.

Buradaki bu düzeneği kullanacağız; buna ısı çıkarıcı denir. Aslında, OCT donarken onu düzleştirmek için kullanılacaktır. İlk olarak yaptığım şey, oda sıcaklığındaki bloğu alıp buradaki tutucuya yerleştirmektir.

OCT kabarcıklarımdan biraz alın. Burada önemi yok çünkü zaten dışarı itilecekler. Sadece biraz ekleyin, çok fazlasına ihtiyacınız yok.

Isı çekiciyi alın ve tam şuraya yerleştirin. Birkaç saniye bekleyin. Ardından OCT'nin düzgün bir şekilde düzleştiğini görebilirsiniz.

Şu an dokum elimde ve OCT'yi işaretlemem gerekiyor. Tamam, konumunu belirtmek için OCT üzerinde bir nokta işaretleyeceğim. İşte burada, üst kısmı mavi bir noktayla işaretledim.

Şimdi doku bloğunu kalıptan çıkaracağım ve bunu sadece bloğun arkasından iterek yapıyorum. Arkasına nazikçe bastırarak bloğu elime iteceğim ancak tekrar belirtmeliyim ki, dokunun çözülmesini istemiyorum. Bu nedenle onu hemen geri koyuyorum.

Şimdi, üzerine mavi işaret koyduğum doku bloğunu görebilirsiniz. Böylece buranın embriyonun başının üst kısmı olduğunu biliyorum. Koronal kesitler alacağımız için yüz üzerinden kesit almak istiyorum.

Şimdi yapacağım şey, büyük bir damla OCT daha eklemek olacak ve her şey soğuk olduğu için şu an hızlı hareket etmeliyim. Ardından dokumu alıp tam ortaya yerleştireceğim ve önceden hazırlanmış OCT tabanına düz bir şekilde oturduğundan emin olacağım. Şimdi bunun donmasını bekleyeceğim, bu işlem yaklaşık bir veya iki dakika sürecektir.

Dondurma işlemi tamamlandı. Şimdi, çak üzerine monte edilmiş dokuyu alıp başlığın içine yerleştireceğim, mümkün olduğunca düz tutacağım ve ardından iyice sıkılaşana kadar sıkacağım.

Örneği tam bıçağın önüne yerleştireceğim ve ardından, birkaç saniye sürebilecek şekilde ilerleteceğim. Tamam, şimdi dokunun hassas konumlandırmasını yapmak için bıçağın düz kenarını kullanacağım. Sadece kenara bakacağım ve kenarların hizalandığından emin olmak için dokuyu yukarı ve aşağı hareket ettireceğim.

Eğer öyle değilse, biliyorsunuz, şuna benzer bir görüntü oluşabilir. Tabii ki bunu abartıyorum ama burada bıçağa tam olarak düz bir şekilde paralel olmadığını görebilirsiniz. Bu yüzden, mümkün olduğunca düz olduğunu hissedene kadar ayarlamalar yapmaya devam ediyorum.

Bence bu oldukça iyi. Bu yüzden dokunun bıçağa karşı düz bir şekilde kesileceğinden emin olmak için her açıdan bakıyorum ve bunu belirlemek için bıçağın kenarını kullanıyorum. Yukarıdan ve yandan bakıyorum ve doku aslında oldukça iyi görünüyor.

Çok fazla ayarlama yapmama gerek yok, ancak yapmam gerekseydi, sadece başlığın arkasındaki düğmeleri kullanırdım. Bunları sola veya sağa çevirerek, bu şekilde hassas ayarlar yapabildiğinizi görebilirsiniz. Fakat şu an oldukça iyi görünüyor.

Şu anda dokuyu aslında ileriye doğru hareket ettiriyorum. Henüz kesilmiyor çünkü bıçağa temas etmiyor. Doku, OCT içerisine derinlemesine gömülmüş durumda.

Dolayısıyla dokuya ulaşmak birkaç dakika sürebilir. OCT'ye ve dokunuza takılıp onları çatlatabileceği için çok hızlı ilerlemek istemezsiniz, ancak çok yavaş ilerlemek de işlemin çok uzun sürmesine neden olur. Bu makinede, daha kalın bir kesit ile düzeltme (trim) yapmanıza olanak tanıyan ve böylece daha hızlı ilerlemenizi sağlayan kullanışlı bir özellik bulunmaktadır.

Şu anda OCT tabakasını kesiyorum, bu yüzden hızımı biraz düşürüyorum. Henüz dokuya ulaşmadım ancak bu aşama, kesit alma işleminin nasıl ilerleyeceğini değerlendirdiğim zamandır. Birçok değişken, doku kesit alma işleminin çok iyi veya çok kötü gitmesine neden olabilir.

Bu kriyostatla en sık karşılaştığım durum, dokunun aslında biraz fazla soğuk olmasıdır. Sıcaklığı düşürdüm ancak yine de biraz fazla soğuk görünüyor. Bunun sonucunda ise bıçak, doku ve OCT boyunca titreme yaparak ilerlemektedir.

Böylece OCT boyunca bu küçük çizgileri, bu yatay çizgileri göreceksiniz. Benim yaptığım şey, başparmağımla OCT'nin kenarını, sadece hafifçe dokunarak ve başparmağımı kaydırarak, çok uzun süre olmadan ısıtmaktır. Daha sonra kesit aldığımda, sonuçların çok daha iyi çıktığını ve titremenin durduğunu fark ettim.

Dokuya geçmeden önce değerlendireceğim şeyler bunlar. Bıçak dokudan geçerken, OCT içerisinde bir takılma veya aslında bir çatlak olduğunu fark ettim. Bu nedenle ilk yaptığım işlerden biri bıçağı değiştirmektir.

Bu bıçağın ne kadar süredir burada olduğu ve benden önce kimin kullandığı konusunda emin değilim, bu yüzden doğrudan yeni bir bıçak takacağım. Bunlar belli ki çok keskin, bu yüzden dikkatli olmalısınız. Şimdi anti-roll plakasını ayarlayacağım; alt kısımda, altına uzanarak içeri veya dışarı hareket ettirebileceğiniz yaylı bir vida bulunmaktadır.

Dokuya ulaşana kadar yeterince ilerleme ve kesit alma işlemi gerçekleştirdim. Ne yazık ki OCT bloğunda bir çatlak meydana gelmiş; bu durum sıkça yaşanır ve maalesef kontrol etmeniz pek mümkün değildir, ancak bunu düzeltmek için yapabileceğiniz şeyler vardır. Eğer çatlak dokunun içinden geçmiş olsaydı, örneği imha etmeniz veya kurtarabildiğiniz kadarını kurtarmaya çalışmanız gerekirdi.

Bu durumda, çatlak dokunun üzerinde görünüyor. Bu yüzden, kriyostatın içinde beklemiş ve soğumuş olan bir jilet kullanacağım.

Şimdi, OCT bloğunun üst kısmında bulunan çatlak bölümü sadece kırpmaya çalışacağım. Tekrar, OCT bloğunun yüzeyini ısıtmak için başparmağımı kullanacağım. Ardından kesit alacağım ve burada görebileceğiniz üzere, bloğun çatladığını fark edeceksiniz.

Ardından dokunun bulunduğu parçayı çıkardım ve OCT'nin geri kalanını, yani çatlamış olan kısmı ayırdım. Şimdi, soğutulmuş bir jilet kullanarak bu çatlamış kısmı kırpmaya çalışacağım. Çok düz bir şekilde ilerlemem gerekiyor; bu yüzden her iki elimi de kullanmalı ve jilet üzerine eşit basınç uygulamalıyım.

Bıçağı OCT içine ileri geri sallayacağım. İleri geri sallayarak OCT'yi yavaşça kesiyorum. Umarım çatlak olan kısmı çıkarabiliyorumdur.

Tamam, bu fazla OCT'yi temizleyerek kesme işlemini yapacağım. Tamam, güzel görünüyor. Ardından baş kısmını hafifçe geri çekeceğim çünkü bıçağa takılabilecek kenarlar oluşturdum ve eğer bu gerçekleşirse, OCT ve doku parçası kopabilir, bu da örneğimi bozabilir.

Geri çekildim, bu yüzden dokuya tekrar girebilmek için biraz daha ilerlemem gerekecek ve umuyorum ki çatlağı düzeltmişimdir. Tamam, şimdi dokuya tekrar giriyorum. Tamam, görünüşe göre düzeltmişim.

Böylece OCT'de kesitlerin alınmasını çok daha kolaylaştıracak herhangi bir çatlak kalmadı. Şimdi dokunun ilgilendiğim kısmına ilerleyeceğim. Şu anda yüzeye yeni ulaşıyorum ve bu embriyonun beynine girmek istiyorum.

Bunlar, ilgilendiğim yapıları gerçekten görebileceğim kadar büyüktür. Görüntüleyeceğim her kesit arasında bıçağı temizlemek için bu fırçaları kullandığımı belirtmeyi unuttum. Bu büyük olan ise sadece alanı temizlemek ve fazla OCT'yi uzaklaştırmak içindir.

Kesiti yakalarken konumlandırmak için, kesiti buradaki soğuk plakaya karşı hareket ettirmek amacıyla bu daha ince fırçaları da kullanıyorum. OCT'nin eriyip fırçalara yapışmaması için bunlar da soğuk tutulur. Dokuyu yakalamak için, önce başparmağımla OCT ve dokuyu ısıtacağım.

Halihazırda etiketlediğim bu lamlardan birini alacağım. Lamı ters tutuyorum; herkes bunu farklı şekilde yapar ama ben, lam aşağı bakarken sağ üst köşeyi sağ elimle tutmayı tercih ediyorum.

Ardından, plakaya karşı düz bir şekilde aşağı inip kesiti alabilmek için sol baş parmağımı bir pivot noktası olarak kullanıyorum. OCT ve doku aslında lam üzerine eriyerek kendi kendine monte olacaktır. Bu nedenle, önce baş parmağımla dokuyu ısıtacağım, yavaşça kesit alacağım, lamımı tutacağım, sağ köşesini sağ elimle kavrayacağım, plağı hareket ettireceğim, düz bir şekilde aşağı indireceğim ve erimesini bekleyeceğim.

Kıvrımların veya kabarcıkların olmadığından ve görünümün uygun olduğundan emin olmak için dokuyu inceleyeceğim. Tüm beyin boyunca kesit alana kadar bu işleme devam edeceğim. Şu an, kesitlerin düzgün göründüğünden emin olmak için diseksiyon mikroskobu altında kesitlere bakıyorum; hepsi düzgün görünüyor, kesitin üst kısmında ön beyni görebilirsiniz ve tamamı oldukça iyi görünüyor.

Bu kriyoseksiyonları, in situ hibridizasyon gibi işlemler için kullanabilirsiniz. Bazen temel histoloji ve H&E boyamaları yapıyoruz. Ayrıca immünofloresan ve buna benzer birçok analiz de gerçekleştirebilirsiniz.

Özellikle benim çalışmamda, bu kesitler in situ hibridizasyon için fikse edildi ve işlendi. Dolayısıyla bir sonraki aşamada bunu yapacağım.