Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dört farklı hücre popülasyonunu veya hücresel kompartımanını seçici olarak işaretlemek için M orange two andron floresan proteinlerini çift problu optik vurgulama yönteminde kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle tüm yeşil floresansı kapatmak için hücrelerin düşük yoğunluklu 488 nanometre eksitasyon ışığı ile aydınlatılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler m orange floresansını kırmızıya fotokonverte eden yüksek yoğunluklu 488 nanometre eksitasyon ışığına maruz bırakılır.

Ardından, çift floresanışı aktive etmek amacıyla hücreler 800 nanometre iki foton eksitasyonuna maruz bırakılır. Tekrar, M Orange two ve drawn ppa ile yapılan çift prob optik belirginleştirmeye dayanarak hücrelerin dört farklı kombinasyonda etiketlenmesinin mümkün olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu prosedürün süb hücresel fraksiyonasyon gibi mevcut deneylere göre temel avantajı, canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilmesidir.

Bu prosedür, insülin veziküllerinin neden sadece küçük bir kısmının salgılandığı gibi beta hücresi biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür beta hücresi fonksiyonuna dair içgörü sağlayabilse de diğer sistemlere de uygulanabilir. Örneğin, kanser hücrelerinin in vivo takibinde kullanılabilir. Floresan protein damlacık örneği, su fazında bulunan bir floresan protein içeren oktal su emülsiyonundan oluşur.

Bu emülsiyon, mikroskopi uygulamaları için bir mikroskop lamı ile 22 milimetrelik kare bir lamelle arasına yerleştirilir. Bu prosedürün başlangıcında, mikroskop lamları ve lamel temizlenmeli ve hidrofobik bir ajanla kaplanmalıdır. Cam malzemeleri beş dakika boyunca asetonla yıkayarak temizleyin.

Yıkama işleminden sonra, cam malzemeleri havada kurumaya bırakın. Ardından, aseton içerisinde %2'lik metil trimetoksisilan çözeltisi hazırlayın ve cam malzemeleri iki dakika boyunca bu çözeltide kaplayın. Kaplama işleminden sonra, cam malzemeleri çözeltiden çıkarın ve kurumaya bırakın.

Ardından cam malzemeleri bir sprey şişesi yardımıyla %70 ethanol ile durulayın. Durulama işleminden sonra cam malzemelerin tekrar havada kurumasını bekleyin ve kalan tüm sıvıları uzaklaştırın. Basınçlı hava kullanılarak, kaplanmış cam malzemeler en az bir ay boyunca saklanabilir.

Cam malzemeler hazırlandıktan sonra, daha önce E. coli'den his etiketli protein olarak saflaştırılmış floresan proteinleri temin edin. Saflaştırılmış proteinin absorbans spektrumunu ölçün. %0,1 sığır serum albümini içeren, pH 8 değerindeki tris tamponlu salin çözeltisi ile optik yoğunluğu yaklaşık 0,1 olan bir stok dilüsyon hazırlayın.

Ek olarak, 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 1:1 oranında oktanol ve tris tamponlu salin solüsyonundan oluşan 10 mililitrelik bir karışım hazırlayın ve kuvvetlice karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, faz ayrımı tamamlanana kadar karışımı bekletin. Üst faz oktanoldür; emülsiyonu oluşturmak için bir epi orph tüpüne 45 µL oktanol ve 5 µL floresan protein pipetleyin.

Emülsiyon oluşumunu başlatmak için tüpe birkaç kez vurun, ardından tüpü bir sonikasyon banyosunda 30 saniye boyunca sonike edin. Bu sırada, sonikasyon sonrası için kaplanmış bir mikroskop lamı ve lamelini hazırlayın. Emülsiyon tamamen bulanık olmalıdır.

Tüpteki emülsiyondan dört µL'yi hemen tüpün ortasından kaplamalı bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin ve üzerini kaplamalı bir lamel ile kapatın. Emülsiyon, mikroskop lamı ile lamel arasında eşit şekilde yayılmalıdır. Birkaç dakika içinde örnek stabilize olacaktır.

Aşağıdaki prosedür, konfokal lazer tarama mikroskobunda floresan protein fotokonversiyon deneyi kurmak için genel bir stratejidir. Bu prosedür, hem saflaştırılmış proteinler hem de canlı hücreler için uygulanabilir. Bu deneyde, fotokonversiyon deneyi için genel bir başlangıç noktası olarak saflaştırılmış m orange two protein içeren bir damlacık örneği kullanılmıştır.

Konfokal lazer tarama mikroskobunu şu şekilde kurun. 40 x 1.3 sayısal açıklıklı yağ daldırma objektif ve 512 x 512 piksel görüntü boyutu kullanın. Piksel bekleme süresini tarama başına altı mikrosaniye, yakınlaştırmayı dört olarak ayarlayın ve iğne deliği boyutunu üç mikronluk bir Z çözünürlüğüne uygun olacak şekilde artırın.

Başlangıç ve fotokonverte floresans ile bir fotokonversiyon kanalı için iki tespit kanalı yapılandırın. Turuncu türü 561 nanometre eksitasyon ışığı kullanarak gözlemleyin ve 570 ile 630 nanometre arasındaki floresansı toplayın. Fotokonverte kırmızı türü 633 nanometre eksitasyon ışığı kullanarak tespit edin ve 640 ile 700 nanometre arasındaki floresansı toplayın.

Fotokonversiyon kanalı için 488 nanometre lazer hattını seçin ve 490 ile 540 nanometre arasındaki floresansı toplayın. Görüntüleme. Fotokonversiyon kanalı kesinlikle gerekli değildir ancak yardımcı olabilir. Deneye başlamak için, optimum görüntü kalitesi adına lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlamak amacıyla başlangıç floresansını sürekli tarama ile görüntülemek için dedektör kanalını kullanın.

Ardından fotokonversiyon kanalını aktive edin ve düşük lazer gücünü seçin. Bir time-lapse serisinin görüntülenmesine başlayın ve başlangıç floresanında belirgin bir ağarma (bleaching) gözlemlenene kadar fotokonversiyon lazerini kademeli olarak artırın. Başlangıç floresansı yaklaşık %75 oranında ağarana kadar taramaya devam edin.

Ardından, foto-dönüşüm kanalını devre dışı bırakın ve foto-dönüştürülmüş floresans için tespit kanalını etkinleştirin. Görüntülemeye, düşük lazer gücünde yüksek dedektör kazancı ile başlayın. Daha sonra, foto-dönüştürülmüş floresans tespit edilene kadar lazer gücünü kademeli olarak artırın.

Saptama işlemi gerçekleştikten sonra, optimal görüntü kalitesi için lazer gücünü ve detektör kazancını (gain) ayarlayın. Son olarak, fotokonversiyon için kullanılan lazer gücünü ve süresini optimize edin. Lazer gücünün artırılması, fotokonversiyon hızını artıracaktır.

Ancak, çok fazla lazer gücü proteinin fotobeyazlamasına neden olacaktır. Optimal fotodönüşüm, lazer gücü ve süresi belirlendiğinde, bu parametreler standart bir fotobeyazlama modülünü veya fotobeyazlama sonrası floresan geri kazanım modülünü yapılandırmak için kullanılabilir. Bu durumda, M orange two'nun Redshift spektral özellikleri nedeniyle fotodönüşüm kanalına artık ihtiyaç duyulmayacaktır.

Çift problı optik belirginleştirme için, PU olarak çizilen yeşil foto-anahtarlanabilir floresan protein ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Çift problı optik belirginleştirmeye başlamak için, HeLa hücrelerini cam tabanlı mat tech kaplarında büyütün; görüntülemeden 24 saat önce, standart bir LIPECTOMY 2000 transfeksiyonu kullanarak hücreleri floresan proteinleri kodlayan plazmidlerle transfekte edin.

Canlı hücreleri bir konfokal lazer tarama mikroskobuna yerleştirin ve mikroskobu, daha önce açıklandığı şekilde M orange two foto-konversiyonu için ayarlayın. Ardından mikroskobu DPA foto-anahtarlama için yapılandırın. DPA, 488 nanometre ışık ile uyarılır ve floresansı M orange two foto-konversiyon kanalı kullanılarak görüntülenebilir.

MPA görüntüleme için kullanılan lazer gücünü minimize ettiğinizden emin olun, çünkü aşırı lazer gücü mpa'nın inaktivasyonuna neden olacaktır. 800 nanometre iki fotonlu eksitasyon kullanarak MPA fotoaktivasyonu için bir kanal ekleyin; ardından fotoaktivasyon ve fotoinaktivasyon OFA floresansı için gerekli olan lazer gücünü belirleyin.

Bu prosedürün en zor yanlarından biri, M orange'ı fotokonvertasyona uğratmadan RPA'yı inaktive etmektir. Çünkü her iki olay da aynı dalga boyunda gerçekleşir. Bunu önlemek için, fotokonversiyonun dikkatlice optimize edilmesi oldukça önemlidir.

Lazer gücü ve süresi; M orange two'nun fotodönüşümü ve PU'nun inaktivasyonu 488 nanometre ışık ile uyarılma üzerine gerçekleştiğinden dikkatli olunmalıdır; böylece belirgin bir m orange two fotodönüşümü olmadan PU inaktive edilebilir. M orange two fotodönüşümü ve DPA foto-anahtarlama parametreleri belirlendikten sonra daha düşük bir lazer gücü kullanın.

Çift problu optik vurgulama gerçekleştirilebilir. İlk olarak, düşük güçlü 488 nanometre eksitasyon ile tüm görüş alanındaki DPA floresansı inaktive edin. Ardından bir ilgi bölgesi seçin ve yüksek güçlü 488 nanometre eksitasyon ile m orange two'yu dönüştürün.

Son olarak, bir ilgi alanı seçin ve 800 nanometre iki foton uyarımı kullanarak DPA floresansını aktive edin. Floresan protein damlacık örnekleri, konfokal mikroskop foto-dönüşüm uygulamalarının kurulması için idealdir. Damlacık örneği doğru şekilde hazırlandığında, damlacıklar oldukça homojen görünür.

Ancak, numune lam ve lamel kaplanmadan hazırlandığında, hazırlanan numunelerdeki damlacıklar cam yüzeylerden birine doğru ezilme eğilimi gösterir. %0,1 BSA yokluğunda, floresan protein tek bir su arayüzünde birikme eğilimi gösterir. Floresans fotokonversiyon halesi oluşturmak, lazer gücüne ve maruz kalma süresine kritik düzeyde bağımlıdır.

Çok yüksek lazer gücü veya çok uzun pozlama süresi fotobeyazlamaya (photobleaching) neden olur ve fotokonvertize edilmiş kırmızı floresansın azalmasıyla sonuçlanır. M orange two ve PHO'nun belirgin spektral özellikleri, fotokonversiyon öncesinde çift prob ile optik vurgulamaya olanak tanır; M orange two, histone H two B ve DPA mito eksprese eden hücreler, çekirdekte turuncu floresans ve mitokondrilerde yeşil floresans gösterir. Düşük güçlü 488 nanometre eksitasyon ile tüm floresans kapatıldığında, M orange'ın fotokonversiyonu minimum düzeydedir.

M orange two, ardından yüksek güçlü 488 nanometre eksitasyon ile kırmızıya fotokonverte edilebilir. M orange two fotokonverte edildikten sonra, çizilen puff floresansı 800 nanometre iki foton eksitasyonu kullanılarak tekrar açılabilir. Çift problı optik vurgulama ile hücreler dört farklı şekilde etiketlenebilir.

Bu teknik kullanılarak, dört farklı hücre popülasyonunun spesifik olarak işaretlenmesi mümkündür. Gördüğünüz gibi, bu prosedürün en zor yönlerinden biri, m orange'ı fotokonverte etmeden MPA'yı inaktive etmektir. Bu yöntem kavrandıktan sonra, örneğin pankreatik beta hücrelerindeki çoklu popülasyonların takibi gibi, bu sistem kullanılarak daha ileri deneyler gerçekleştirilebilir.

İşte hepsi. Umarım bu sunumu yararlı bulmuşsunuzdur, deneylerinizde başarılar dilerim.