Görüntüleme Ca Teknikleri ^{2 +} İnsan Sperm sinyal

Bu prosedürün genel amacı, önce bir floresan kalsiyum raportör kalıbı ile etiketlenmiş hareketsiz hale getirilmiş insan sperminden görüntü serileri elde etmektir. Motil hücreleri, inkübasyon ortamına yüzdürülerek seminal plazmadan izole edilir. Kapasitasyon hücreleri floresan kalsiyum indikatörü ile etiketlendikten sonra, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine monte edilmiş eriyebilir bir görüntüleme odasına aktarılır.

Kalsiyum iyonu konsantrasyonu tepkileri, hızlandırılmış bir görüntü serisi olarak yakalanır ve tek hücre tepkilerini çıkarmak için analiz edilir. Merhaba, ben İngiltere'deki Birmingham Üniversitesi Biyolojik Bilimler Okulu'ndaki Dr.Steven J.Public Cova'nın laboratuvarından Edwin Andres Morales Garcia. Ben Katherine Nash, aynı zamanda Public Overlap'ten.

Ve ben Public Overlap'ten Jennifer Morris. Bugün, bireysel insan perato toprağında hücre içi kalsiyum tepkilerini görüntüleme prosedürünüzü göstereceğiz. Bu prosedürü, yumurta ve dişi tuzağından elde edilen uyaranları kullanarak sperm aktivitelerinin düzenlenmesini incelemek için laboratuvarımızda kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Semen örneklerini toplama anından itibaren 37 santigrat derecede 30 dakikadan fazla olmamak üzere saklayın motor hücreleri seminal plazma PET'ten izole etmek için% 0.3 BSA ile desteklenmiş bir mililitre L'S denge tuzu çözeltileri, S-E-B-S-S olarak kısaltılır beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpler. Her tüpte S-E-B-S-S'yi 0,3 mililitre meni ile nazikçe altına yerleştirin ve tüpü gevşek bir şekilde kapatın.

Tüpleri 45 derecelik bir açıyla bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksitte inkübe edin. Hareketli hücrelerin S-E-B-S-S'ye doğru yüzmesine izin vermek için, üstteki 0.7 mililitrelik çözeltiyi yavaşça çekin ve çözeltiyi tüm tüplerden temiz bir 15 mililitre polistiren santrifüj tüpüne çekin. Yeni bir bağırsak sayma odasında formalin ile hareketsiz hale getirilmiş sayım hücrelerini karıştırmak için hafifçe çalkalayın.

Konsantrasyonu S-E-B-S-S'de mililitre başına 6 milyon hücreye getirin ve spermi beş mililitre polistiren yuvarlak tabanlı tüplerde 200 mikrolitrelik alikotlara bölün. Gevşek bir şekilde kapatın. Kapasitif hücrelerin tepkisi inceleniyorsa, tüpleri 37 santigrat derecede ve% 6 karbondioksitte beş ila altı saat inkübe edin Kapasitasyona izin vermek için 10 mikrolitre% 10 polilisin uygulayın 22 x 50 milimetrenin merkezine küçük damlalar olarak.

Bir numaralı kapak kaymağı ve tamamen kurumasını bekleyin. Kapak kayması ile muamele görmüş tarafı yukarı bakacak şekilde inşa edilmiş eriyebilir bir görüntüleme odasına takmak için vakumlu gres kullanın. Amaç için.

Her görüntüleme deneyi için, tek bir kapasitif hücre tüpü seçin ve mililitre başına 1.2 mikrolitre 2.5 miligram ekleyin. Kalsiyuma bağımlı organ yeşili, 10 mikromolar nihai konsantrasyon için DMSO'da çözülür. Tüpü 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksitte 40 dakika inkübe edin.

P 200 uçlu 200 mikrolitrelik bir Pepto kullanarak, tüm çözeltiyi tüpten tamamen çıkarın. Giriş portuna hafifçe enjekte ederek hazneyi doldurun. Hazneyi, kabarcıklar dışarı akıştan çıkacak şekilde eğin.

Tüm hazneyi inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksitte 20 dakika daha inkübe edin. Spermin poli D lizine yapışmasına izin vermek için. Hazneyi ters çevrilmiş floresan mikroskoba monte edin ve perfüzyon aparatına bağlayın.

Perfüzyonun süpürülmesine izin vermek için hazırlığı en az 10 dakika karanlıkta bırakın. 40 x veya 60 x büyütmede faz kontrastı altında gevşek hücreler ve hücre dışı kalıplar, her hücreden floresansın ayrı ayrı değerlendirilmesine izin vermek için hücre aralığının yeterli olduğu bir görüş alanı seçin. Hücreler yeterince bağlanmalı, ancak tercihen net bir peder verme faaliyeti sergilemelidir.

Mikroskobu yeşil floresan kanalına geçirin. Net bir floresan görüntü için pozlama sürelerini gereken minimumda tutun. IQ yazılımında foto ağartmayı azaltmak için.

Zaman serisi görüntü alımını etkinleştirin. Görüntüleri 0,1 hertz'de alın ve aydınlatmayı sınırlamak için yazılım kontrollü bir deklanşör kullanın. Başlangıçta üç ila beş dakikalık bir kontrol periyodu için kayıt yapın, salinin kalsiyum konsantrasyonunu manipüle edin ve perfüzyon sisteminin başlığındaki salini değiştirerek ilaçları uygulayın.

Her bir uyaranın başlığa eklendiği zamana dikkat edin ve bu protokolün yazılı bölümünde açıklandığı gibi odaya varış süresini hesaplayın. Görüntüleri çevrimdışı olarak analiz etmek için, buradaki her bir hücrenin veya bir hücrenin bir bölümünün etrafındaki bir ilgi bölgesini veya yatırım getirisini ana hatlarıyla belirtmek için çizim araçlarından birini kullanın, çünkü bu alanda mobilize olarak depolanan kalsiyum. Görüntü serisini kontrol etmek için kaydırma çubuğuyla kaydırın.

ROI içinde tam olarak kalmayan, diğer hücrelerle örtüşen veya büyük ve hızlı bir artış gösteren hücreleri tanımlayın ve çıkarın, ardından hücre ölümünün karakteristik özelliği olan floresan yoğunluğunda keskin bir düşüş izleyin. Her ROI için bir zaman floresan yoğunluğu serisi oluşturmak için analiz işlevini kullanın. Veriler daha sonra bir elektronik tablo sayfasında dışa aktarılabilir ve analiz edilebilir.

Bu görüntüler, üç mikromolar progesteron ile stimülasyon sırasında elde edilen bir seridendir. Alt sıra sahte renkle kaplanmıştır. Bağıl yoğunluk değişikliklerini daha iyi göstermek için, progesteron burada odaya girdi. Burada.

Bu sonuçlar hızlandırılmış bir videoda canlandırılır. Floresan yoğunluğundaki hızlı artışa ve ardından hücre içi kalsiyum seviyelerinde karşılık gelen değişiklikleri gösteren yavaş bir artışa dikkat edin. Bu veriler burada üç hücrenin arka başının ortalama yoğunluklarından ölçülür.

Okla işaretlenen zamanda üç mikromolar progesteron eklendi. Çizgi çizgisi, ortalama kontrol floresansını gösterir. Bugün size kaliteli hücreleri nasıl izole edeceğinizi, onları kalsiyuma duyarlı bir boya ile nasıl yükleyeceğinizi ve tek tek hücrenin stimülasyona tepkisini nasıl izleyeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, mümkün olan en iyi hücre popülasyonunu kullanmayı unutmamak, ayrıca fotoğraf hasarını önlemek için hücrelerin aydınlatmasını en aza indirmek ve en iyi baktığınız yanıtlara uyan boyayı seçmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.