Görüntüleme Ca Teknikleri ^{2 +} İnsan Sperm sinyal

Bu prosedürün genel amacı, floresan kalsiyum raporlayıcı boya ile işaretlenmiş immobilize insan sperm hücrelerinden görüntü serileri elde etmektir. Hareketli hücreler, inkübasyon ortamına doğru yüzdürülerek seminal plazmadan izole edilir. Kapasitasyondan sonra hücreler floresan kalsiyum indikatörü ile işaretlenir ve ardından evirilmiş floresan mikroskoba monte edilmiş bir füzyon görüntüleme odasına aktarılır.

Kalsiyum iyon konsantrasyon yanıtları, bir zamanlapse görüntü serisi olarak kaydedilir ve tek hücre yanıtlarını çıkarmak için analiz edilir. Merhaba, ben Birmingham Üniversitesi Biyobilimler Okulu'ndaki Dr. Steven J. Public Cova laboratuvarından Edwin Andres Morales Garcia. Ben de Public Overlap'ten Katherine Nash.

Ben Public Overlap'tan Jennifer Morris. Bugün, tekil insan peritubüler hücrelerinde hücre içi kalsiyum yanıtlarının görüntülenmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, yumurta ve dişi kanalından türetilen stimülasyonlar kullanarak sperm aktivitelerinin düzenlenmesini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Motor hücreleri seminal plazmadan izole etmek için, toplama anından itibaren semen örneklerini 37 °C'de 30 dakikadan fazla tutmayın. %0,3 BSA ile desteklenmiş, kısaltması S-E-B-S-S olan 1 mL L'S balans tuz çözeltisini bir dizi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpe ekleyin. Her tüpteki S-E-B-S-S üzerine 0,3 mL semeni nazikçe yerleştirin ve tüpün kapağını gevşekçe kapatın.

Tüpleri 37 °C ve %6 karbon dioksit ortamında, 45 derecelik bir açıyla bir saat boyunca inkübe edin. Hareketli hücrelerin S-E-B-S-S içine yüzmesini sağlamak için, üstteki 0.7 mL çözeltiyi yavaşça pipetle çekin ve tüm tüplerdeki çözeltiyi temiz bir 15 mL polistiren santrifüj tüpüne aktarın. Karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve formalin ile immobilize edilmiş hücreleri yeni bir bowel sayım odasında sayın.

Konsantrasyonu S-E-B-S-S içerisinde mililitre başına 6 milyon hücreye getirin ve spermi, beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüplere 200 µL'lik alikotlar halinde paylaştırın. Kapakları gevşekçe kapatın. Kapasite kazanmış hücrelerin yanıtı inceleniyorsa, kapasitasyona izin vermek için tüpleri 37 °C ve %6 CO2'de beş ila altı saat inkübe edin. 22 x 50 mm'lik bir lamın merkezine, birkaç küçük damla şeklinde 10 µL %10 polilizin uygulayın.

Bir numaralı lamelle kaplayın ve tamamen kurumasını bekleyin. İşlem görmüş tarafı yukarı gelecek şekilde lameli, bu amaçla oluşturulmuş füzyon görüntüleme odasına vakum gresi kullanarak sabitleyin.

Her görüntüleme deneyi için, kapasite kazanmış hücrelerin bulunduğu tek bir tüp seçin ve 10 µM son konsantrasyon elde etmek için DMSO içinde çözünmüş 2,5 mg/mL kalsiyum bağımlı organ green çözeltisinden 1,2 µL ekleyin. Tüpü 37 °C ve %6 CO2 koşullarında 40 dakika boyunca inkübe edin.

P 200 ucu takılmış 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, tüpteki solüsyonun tamamını tamamen boşaltın. Giriş portundan nazikçe enjekte ederek hazneyi doldurun. Kabarcıkların çıkış portundan çıkması için hazneyi eğik tutun.

Tüm hazneyi inkübatöre yerleştirin ve 37 °C ile %6 karbondioksit altında 20 dakika daha inkübe edin. Spermlerin poli D lizin yüzeyine tutunmasını sağlayın. Hazneyi evirtilmiş floresan mikroskoba monte edin ve perfüzyon aparatına bağlayın.

Perfüzyonun temizlenmesi için preparatı en az 10 dakika boyunca karanlıkta bekletin. Serbest hücreler ve hücre dışı kalıntılar faz kontrastında 40x veya 60x büyütme altında incelenirken, her bir hücreden gelen floresansın ayrı ayrı değerlendirilmesine olanak tanıyacak kadar yeterli hücre aralığının bulunduğu bir görüş alanı seçin. Hücreler yeterince yapışmış olmalı, ancak tercihen belirgin filopod aktivitesi sergilemelidir.

Mikroskobu yeşil floresan kanalına getirin. Pozlama sürelerini, net bir floresan görüntü için gereken minimum seviyede tutun. IQ yazılımındaki fotobeyazlamayı azaltmak için.

Zaman serisi görüntüleme işlemini başlatın. Görüntüleri 0.1 hertz hızında elde edin ve aydınlatmayı sınırlamak için yazılım kontrollü bir perde kullanın. Başlangıçta üç ila beş dakikalık bir kontrol süresi boyunca kayıt yaptıktan sonra, perfüzyon sisteminin giriş kısmındaki salini değiştirerek salinin kalsiyum konsantrasyonunu düzenleyin ve ilaçları uygulayın.

Her bir stimülasyonun başlığa eklendiği zamanı not edin ve bu protokolün yazılı bölümünde açıklandığı gibi oda içerisindeki varış zamanını hesaplayın. Görüntüleri çevrimdışı analiz etmek için, çizim araçlarından birini kullanarak her bir hücrenin veya hücrenin belirli bir bölümünün etrafına bir ilgi alanı veya ROI çizin; burada depolanmış kalsiyum bu bölgede mobilize olduğu için posterior sperm başı seçilmelidir. Görüntü serisini kontrol etmek için kaydırıcı çubuğu kullanın.

ROI sınırlarının tamamen dışında kalan, diğer hücrelerle örtüşen veya hücre ölümüyle karakterize olan, floresan yoğunluğunda önce büyük ve hızlı bir artış ardından keskin bir düşüş gösteren hücreleri belirleyin ve çıkarın. Her bir ROI için bir zaman floresan yoğunluk serisi oluşturmak amacıyla analiz fonksiyonunu kullanın. Veriler daha sonra dışa aktarılabilir ve bir hesap tablosu sayfasında analiz edilebilir.

Bu görüntüler, üç mikromolar progesteron stimülasyonu sırasında elde edilen bir seriden alınmıştır. Alt sıraya yalancı renk kaplaması uygulanmıştır. Göreceli yoğunluk değişimlerini daha iyi örneklendirmek için progesteron buradaki hücre odasına girmiştir.

Bu sonuçlar, hızlandırılmış bir videoda canlandırılmıştır. Hücre içi kalsiyum seviyelerindeki karşılık gelen değişiklikleri belirten, floresan yoğunluğundaki hızlı yükselişin ardından gelen yavaş artışa dikkat edin. Bu veriler, burada üç hücrenin posterior baş kısmının ortalama yoğunluklarından nicelleştirilmiştir.

Okla işaretlenen zamanda üç mikromolar progesteron eklenmiştir. Kesikli çizgi, ortalama kontrol floresansını göstermektedir. Bugün sizlere yüksek kaliteli hücrelerin nasıl izole edileceğini, kalsiyum duyarlı bir boya ile nasıl yükleneceğini ve tekil hücrelerin stimülasyona verdiği yanıtın nasıl izleneceğini gösterdik.

Bu prosedürü uygularken, mümkün olan en iyi hücre popülasyonunu kullandığınızı hatırlamanız, ayrıca fotohasarı önlemek için hücrelerin ışığa maruz kalmasını en aza indirmeniz ve gözlemlemek istediğiniz yanıtlar için en uygun boyayı seçmeniz önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.