Name: Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Öğrenin geç evre Drosophila pupa beyinlerinden primer nöronal kültür hazırlama yöntemini. Merkezi beyin bölgesi yetiştirilerek nörit uzantısı ve kalsiyum görüntüleme ile sinir gelişimi incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe NS27501 tarafından desteklenen DKOD. Bu iş için ek destek, DKOD HHMI Profesör Programı aracılığıyla destek UC Irvine hibe sağlanmıştır.

Kültür gün önce hazırlıklar: <ol><li> Steril diseksiyon çözüm olun. </li><li> Steril DMEM olun ve 10 ml alikotları tutmak, 4 ° C 2 hafta boyunca. </li><li> 1 ay için 50 veya 100 ul alikotları steril DDM2 takviyeleri ve donma olun. </li><li> CONA / laminin olun. </li><li> Kat lamelleri. İsteğe Bağlı: 4 ay kadar donmuş steril Cnbm ve mağaza olun. </li></ol> Kültür, günü I. laminer akış kaput Enzim Çözümü (ES) hazırlayın <ol><li> 5 ml, 15 ml santrifüj tüpüne çözüm diseksiyon (DS) koyun. </li><li> 0.6 ml Eppendorf 0.8 mg L-Sistein tartılır ve DS 150 ul ekleyin. Kristaller gidene dek, yukarı ve aşağı Pipet. </li><li> 150 ml 5 ml DS DS / Sistein ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 50 U Papain (adet) ekleyin. </li><li> 7 ml 0.1 N Na OH ekleyin ve iyice karıştırın. Çözüm 30 dakika içinde açık olacak. aktive edildiğinde. </li><li> 0,2 mm steril 1,5 ml vidalı kapaklı mikrofuge&#39;de tüp içine şırınga filtresi ile filtre enzim çözeltisi Papain: 5 ml DS 50 U Wanna. Her parti, biraz farklı, bu yüzden ne kadar hesaplamak gerekir: 37.3 mg / ml ve 28.3 U / mg 37.3 x 28.3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47.4 ml </li></ol> II. DDM2 medya yapın Kültür, günü: DDM2 yapmak için aşağıdaki takviyeleri eklemek Için 10 ml DMEM, sadece kültür önce takviyeleri ekleyin: <ol><li> 100μl Transferrin </li><li> 100μl Putrescine </li><li> 100μl Selenyum </li><li> 100μl Progesteron </li><li> 50μl İnsülin </li><li> 10μl 20-Hydroxyecdysone </li></ol> Not: planlanan tüm kültürlerde (her beyin ayrı bir 35 mm Petri kabında tek bir lamel, medya 1.5 ms / kültür kaplama) için yeterli DDM2 olun Adım III-VI yapılan steril olmayan bir laboratuvar tezgahı ve 45 dakika veya daha kısa sürede tamamlanması gerekmektedir. III. Pupa Koleksiyonu <ol><li> Diseksiyon mikroskop altında 10-15 flakon taraftan pupa seçin. </li><li> Pupa, kuru bir 35 mm Petri kabında kapak yerleştirin. </li></ol> Not: Biz genellikle puparium formasyonu (APF) sonra 55-78 saat arasında pupa beyinlerini kullanmak. Neurite akıbet genel düzeyi en eski pupa biraz daha düşük iken baş kapsül, yıkılmaya yüz çünkü genç pupa beyin incelemek için biraz zordur. Canton-S wild tip gerginlik, bu aşamalar, hafif hafif kırmızımsı kahverengi pigmentli gözlerinden başka bir yerde çok az pigment ile tanınır. IV. Diseksiyon mikroskobu altında Decapitation <ol><li> Yeri sonraki iki damla steril diseksiyon çözüm Petri kabı kapağı, pupa. </li><li> Yavaşça sol elinde ince forseps ile tek bir pupa tutun ve ön pupa sonunda manikür kaldırmak için sağ elinde bir 1 cc şırınga, 27 gauge bir şırınga iğne kullanın. </li><li> Forseps ile pupa hafifçe sıkın ve baş çıktığında boyun koparmak için 27 gauge iğne kullanınız. </li><li> Iğne ucu veya forseps ile çözüm diseksiyon bırak baş aktarın. </li><li> 10-15 baş tek bir damla kadar tekrarlayın. </li></ol> Diseksiyon mikroskobu altında kafa beyin V. Kaldırma <ol><li> Her el, 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun. </li><li> Burnumun siz ve başın dorsal yüzeyi kuzeye bakacak şekilde çözüm diseksiyon açılan sinek kafa pozisyonu kullanın. </li><li> Baş aşağı pin ve ventral dorsal yüzeyine gider sağ gözünde bir yarık yapma hakkını saklı iğne kullanmak için burnumun içine sol iğne yerleştirin. </li><li> Burnumun bölgede sol yanında doğru bir iğne takın ve sonra beynin sağ gözü yarık doğru iterek manikür, sol gözün üzerine hafifçe bastırmak için sol iğne kullanınız. Genellikle optik lo hem beyin, nispeten bozulmamış, sağda yarık ortaya gerektiğinibes de hala bağlı ve bazen pigmentli göz dokusu. </li><li> Beyin, yeni bir steril, 35 mm Petri kabı, steril diseksiyon serum fizyolojik damla iğne ve transfer sırtına doğru itin. </li><li> Her genotip için 10-15 beyinleri toplayın. </li></ol> VI. Kaldırılması, optik loblar ve enzim tedavisi <ol><li> 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun ve her elin tüm beyinleri diseksiyon çözüm açılan küçük bir alanda toplamak için bu </li><li> Böylece her bir beyin doku kültürü kalan merkezi beyin bölgesi optik loblar kaldırmak için kesici aletler şırınga kullanın. </li><li> 5 ul 20 ul Pipetman, Eppendorf tüpüne 1 ml steril papain çözüm içeren tek bir genotip tüm beyinleri aktarmak için kullanın. </li><li> Brain için papain 60 devirde bir rotator seti 10-15 dakika inkübe edildi. </li><li> 3000 rpm&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. </li></ol> Steril laminer akış kaputu İçinde tüm adımları doku havaya maruz kalan adımları için laminer akış kaput yapılmalıdır. VII. Yıkama <ol><li> Enzim çözeltisi çıkarın ve steril diseksiyon çözümü ile değiştirin. </li><li> 3000 rpm&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Steril diseksiyon çözümü ile bir toplam 3 kez yıkayın. </li><li> Diseksiyon salin çıkarın ve DDM2 ile değiştirin. </li><li> Santrifüj ve DDM2 ile toplam 2 kez yıkayın. </li><li> Steril bir 35 mm Petri kabında Transfer beyin ve medya. </li></ol> VIII. Diseksiyon mikroskobu altında ezerek toz haline getirme ve Kaplama <ol><li> DDM2 bir lamel merkezinde 5 ul yerleştirin. </li><li> Sarı bir ucu ile DDM2 Bu düşüşün 1 beyin aktarın. </li><li> Mikroskop altında beyin zar kadar küçük parçalar halinde (&lt;1 dakikada almalıdır), 27 gauge iğne kullanın. </li><li> Görsel rehberliği altında, büyük parçalar pipetlemeyin ucu içine yavaşça emilir ve ortama geri sınırdışı böylece iyi bir noktaya çekti damlalıklı cam ucunu kırmak. Biz 100 ul hematokrit kapiller cam ile standart olarak gelir ağız emme boruları kullanın. Not: medya kabarcıkları almak için özen ve kullanmak için en iyi boyutu pipetlemeyin ampirik olarak belirlemek gerekir. İyi olanlar, yaklaşık 30 saniye / beyin, bazı bireysel hücrelerin ve hala bazı büyük öbekler beyin ayırmak izin verir. Yüksek güçte bu baktığınızda, nöronların yaklaşık% 10-20 hala kalan bazı işlemler var ve hala bazı büyük öbekler olacak. Çok ayrıştırmaları varsa, o zaman tüm hücreleri yuvarlak olacak ve onlar hayatta olmaz bu kadar zarar görmüş olacak. Bu adım, uygulama alır ve hızlı bir şekilde değiştirebilirsiniz büyük bir yüzey-hacim oranı ve DDM2 açılan osmolalitesi ve pH olmadığından hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Doku, mümkün olduğunca çabuk CO 2 inkübatör yerleştirilmesi gerekiyor . </li><li> &quot;Genotip, tarih ve saat&quot;: petri kapak yaz. </li><li> , 100 mm petri, 35 mm petri (ıslak kimwipe) koyun ve 30 dakika CO 2 inkübatör yerleşmek izin . </li><li> DDM2 1.5 ml 35 mm tabak Sel. </li><li> % 5 CO 2 inkübatör (23 ° C) inkübatör kültürleri tutun. Not: Eğer bir soğutma CO 2 inkübatör erişim yoksa, standart bir memeli doku kültürü inkübatör kullanımı ve serin bir odada ve ısı 23 ya koymak ° C veya laboratuarda koymak, geçici kapatmak ve kullanmak kuluçka altındaki ortam etrafında düzenleyen geçici bir tepsi buz. </li></ol> IX. Besleme Hücreler <ol><li> CNBM/B27: 1 Gün (ertesi gün), 03:01 DDM2 yapmak CNBM/B27 0.5 ml (Şartlandırılmış Medya) eklemek. </li><li> CNBM/B27: Günlük 5 03:01 DDM2 için 1 ml medya değiştirin. </li><li> CNBM/B27 her 4-5 gün: 03:01 DDM2 besleyen hücrelerin tutun. Not: Kültürleri nöronal olmayan klimalı medya olmadan yetiştirilir ama nöronlar biraz daha kırılgan görünür ve elektrofizyoloji deneylerde kullanılmak için daha zor olabilir. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neurites uzatmak ve fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak embriyonik / postnatal kemirgenler beyinleri hasat nöronlar primer hücre kültürü yetiştirilebilir. Bu kültürlerin hazırlanması için Yöntemleri iyi kurulmuş ve kemirgen nöronal kültürlerin çalışmalar, sinaps oluşumu ve işlevi düzenlenmesi (Banker ve Goslin, 1991) yer alan genler ve çevresel faktörlerin belirlenmesi kritik bir rol oynamıştır. Türlerin çeşitli böcek nöron kültüründe yetişen olabilir, fonksiyonel kültür sinaptik bağlantıları oluşturmak için gösterilen tek böcek nö...

Kaplama lameller: 60 mm petri otoklavlanmış lamelleri koyun. Con pipetleyin 5 ul her lamel merkezi üzerine A / Laminin karışımı. 2 saat boyunca 37 ° C inkübatör yerleştirin. 3x lamelleri ul otoklava su, her biri 100 ile durulayın. Steril bir yeniden süspanse bağlı vakum kullanın. Son durulama sırasında forseps ile lamel pick up ve her iki tarafın da kuru. 35mm Petri kabı lamel aktarın. Bir aya kadar oda sıcaklığında saklayın.

geç stage drosophila pupa brain İlköğretim nöronal kültürler

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Prosedür puparium oluşumundan sonra 70-78 saat hayvanların beyinlerinin kaldırılması ile başlar. Izole beyinleri serum büyüme ortamında birkaç yıkar takip papain kısa inkübasyondan sonra gösterilmiştir. Bir lamel medya 5 ul açılan her bir beyin mekanik ayrılma süreci gösterilmektedir. Post-mitotik nöronların akson ve dendritler disosiasyon sırasında soma yakın sheered ama nöronlar kaplama bir kaç saat içinde süreçleri yeniden başlar. Görüntüler 2 gün canlı kültürler göstermektedir. Nöronlar kültüründe ilk haftasında süreçlerini ayrıntılı olarak devam etmektedir. Spesifik nöronal nüfus, kültür, GFP veya RFP floresan belirteçleri doku belirli bir ifade sürücü GAL4 hatları kullanarak tespit edilebilir. Tüm hücre kayıtları kültürlü nöronların fonksiyonel, kendiliğinden aktif ve GABAerjik kolinerjik sinaps oluşturur göstermiştir. Kısa bir video segment, kültürlü nöronların bir tabak içinde kendiliğinden kalsiyum transientler ve nikotin uyarılmış kalsiyum tepkileri izlemek için bir kalsiyum gösterge boyası olarak Fura-2 kullanarak kültürlü nöronlarda kalsiyum dinamiklerini göstermektedir. Bunlar pupa beyin kültürleri, genetik ve farmakolojik araçları merkezi sinaps oluşumu ve fonksiyonunu etkileyen iç ve dış faktörleri tanımlamak için kullanılabilecek yararlı bir model sistem.

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Bu videoda, geç evre Drosophila pupalarının beyinlerinden primer nöronal kültürlerin hazırlanmasını gösteriyoruz. Prosedür, ... ile başlar.

Benim adım Diana Dowd; UC Irvine'de Anatomi ve Nörobiyoloji ile Gelişimsel ve Hücre Biyolojisi bölümlerinde profesörüm. Bugün size Drosophila pupalarından nöronal kültürlerin hazırlanmasını anlatacağım. Bu işlem, geç evre pupaların beyinlerinin çıkarılmasını içerir ve biz genellikle sadece merkezi beyin bölgesini kültüre ederiz.Bu aşamada, yetişkin beyinde bulunan temel anatomik yapılar halihazırda oluşmuştur. Buna, aksonlarını mantar vücut bölgesine kadar gönderen projeksiyon nöronlarının bulunduğu anten lobları ve aksonlarını alfa, beta ve gama lobları aracılığıyla hedef nöronlarına gönderen mantar vücut nöronları, yani Kenyon hücreleri dahildir. Kültürleme gününde ilk olarak laminer akışlı kabine gireriz ve dokuyu ayrıştırmak için kullanacağımız steril enzim çözeltisini hazırlarız.Ayrıca hücreleri büyütmek için kullanacağımız besiyerini hazırlıyoruz. Bu besiyeri, önceden hazırladığımız stoklardan oluşturulur. Bir sonraki adım, disosiasyon veya diseksiyon için kullanacağımız pupaları toplamaktır.Ve bu işlem çeker ocak dışında gerçekleştirilir çünkü bunlar, maya ve diğer pek çok madde içeren flakonlarda yetiştirilir. Bu nedenle, diseksiyonun ilk aşamalarını aslında çeker ocak dışında yapıyoruz. Bunlar, az önce bir flakonun kenarlarından aldığım pupalardır ve sol taraftaki sırada, kırmızı gözlere sahip olan ve kültürleme için uygun aşamada olan hayvanlar bulunmaktadır.Bunlar biraz daha genç; buradaki PPP'ler biraz daha genç. Turuncu veya sarı gözleri var ve bu uygun bir 1 0 7 hattı. Renklerin bu aşamalarda biraz daha kahverengi olduğu normal yaban tipinden biraz daha parlak gözleri var.Bu aşamaların tamamı kültürleme, yani beyin kültürleri oluşturma için uygundur. Tamam, buradaki ilk adım, Petri kabıma çıkardığım ve sıraya dizdiğim pupaların hemen yanına birkaç damla diseksiyon solüsyonu koymaktır. 35 milimetrelik Petri kaplarının üst kısımlarını kullanıyoruz.Ardından sol elime beş numara olmayan bir forseps ve ucunda 27 gauge iğne bulunan 1 CC'lik bir tüberkülin şırıngası alıyorum. Bunlar benim iki diseksiyon aracım. Başı pupil kılıfından veya pupiden çıkarmak için, temel olarak sol elimdeki forsepsle pupiyi tutuyorum ve ardından sağ elimdeki iğneyi kullanarak pupil kılıfının ön kısmını çıkarıyorum.Ardından kütikül örtüsünü geri çekerim ve baş ön taraftan dışarı çıkar. Daha sonra iğnemi kullanarak boyun bölgesinden kesme işlemini gerçekleştiririm, başı alır ve diseksiyon salini damlasının içine yerleştiririm. İyi bir kültür oluşturmak için her genotipten 10 ila 15 hayvan bulunmasını istediğimden, bu prosedürü 10 ila 15 kez tekrarlayacağım.Şimdi, beyni hayvanın kafasından çıkaracağım. Bunu yapmak için, her biri 27 gauge iğne tutan iki adet tüberkülin şırıngası kullanıyorum. Sol iğneyi, kafayı Petri kabının tabanına sabitlemek için doğrudan hayvanın psis kısmından yerleştiriyorum.Ardından, sağ tarafta bir yarık açmak için sağ iğnemi kullanıyorum ve beyni buradan dışarı iteceğim. Tamam, bir sonraki adım ise sol iğnemi sol gözün üzerine yerleştirmek. Şimdi sadece iteceğim ve beyin, sağ taraftaki yarıktan dışarı çıkmalı.İşte burada. Sağ tarafta görebilirsiniz; şimdi sağ iğnemi kullanarak onu baş kapsülünün geri kalanından ve gözlerden ayırabilirim. Tamam. Şimdi, optik lobların çıkarılacağı son diseksiyona geçmeden önce, beyni temiz bir salin damlasına aktarıyorum.Bunu yapmak için ya bir pipet kullanabilirim; 20 µL'lik bir pipetin tam ucunda alıp beş µL'ye ayarlanmış şekilde kullanırım ya da aslında iğnelerle de transfer edebilirim. Bu, diseksiyon prosedürünün son aşamasıdır. İşlem taze bir salin damlası içinde gerçekleştirilir ve genellikle burada yaklaşık 10 ila 15 beyin bulundururum.Ardından, 27 gauge iğneleri kesme aleti olarak kullanarak her birinden optik lobları çıkarıyorum; her beyindeki önce sol optik lobu, sonra da sağ optik lobu kesiyorum. Bu noktada, bu şekilde işlenmiş tüm beyinler, enzimatik disosiasyon için kullanılacak olan enzim çözeltisini içeren bir tüpe aktarılır. Tek bir genotipe ait tüm beyinler, 1 mL enzim çözeltisi içeren tek bir epikrup kapaklı eppendorf tüpüne konur.Ardından bunları bir deney tüpü tutucuya yerleştirip, oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca kalacakları bir rotatöre koyuyoruz. Disosiasyon süresi esasen budur. Enzim disosiasyon adımını tamamlamak için enzimi aslında uzaklaştırmamız gerekir.Ardından tüpleri bir EOR santrifüjüne getiriyoruz, tüpleri santrifüje yerleştiriyoruz ve 3000 RPM hızında üç dakika boyunca santrifüjlüyoruz. Beyinleri çöktürdükten sonra, onları laminer akışlı kabine getiriyoruz. Prosedürün steril kısmı burada başlamaktadır.Artık tüpü laminer akışlı kabin içerisinde olmadığımız sürece açmıyoruz ve şimdi enzim çözeltisini uzaklaştıracağız. Bunun yerine diseksiyon çözeltisi ekleyeceğiz, ardından hem diseksiyon çözeltisiyle hem de hücreleri büyüttüğümüz tanımlanmış besiyeri (Defined medium) ile birkaç kez santrifüjleyip yıkayacağız. Tamamdır.Burada yapmam gereken ilk şey, bu Petri kaplarındaki her bir lamel üzerine beş mikrolitre salin damlatmaktır. Her Petri kabında bir adet lamel bulunmaktadır ve bunlar laminin ile kaplanmıştır; bu nedenle lamelin tam ortasına beş mikrolitrelik bir damla bırakıyorum. Laminin damlam tam olarak buradadır.Hücrelerinizi alanın tam ortasında toplamak istemeniz nedeniyle bu işlem çok önemlidir çünkü beyin başına yaklaşık 10.000 hücre elde ediyoruz ve tek bir kültür oluşturmak için bu miktarı kullanıyoruz. Tamam, şimdi mikroskoba baktığımızda, enzimle ayrıştırma prosedüründen geçmiş dokuz beyin görüyoruz. Bunların hâlâ büyük ölçüde bütün olduklarını görebilirsiniz.Optik lobları yok. Bunlar çıkarıldı, elimizde sadece merkezi beyin bölgesi var; şimdi tek bir beyni pipetle alıp bir lamel üzerindeki 5 µL'lik damlanın üzerine taşıyacağım. Bunu dört kez tekrarlıyorum.İki adet 1 cc'lik şırınga alıyorum ve uçlarına 27 gauge iğneler takıyorum. Tekrar belirtmek gerekirse, bunların oldukça ucuz ve tek kullanımlık diseksiyon araçları olduğunu not etmek çok önemlidir; böylece lisans öğrencileri bütçe konusunda endişelenmeden bunu yapabilirler. Tamam, şimdi iki iğnem var ve ilk mekanik disosiasyonu gerçekleştireceğim; bu işlem, beyni birkaç parçaya bölmekten ibarettir ve böylece bir dakika içinde nihai disosiasyonu tamamlamak için bu parçaları bir cam pipete çekebileceğim.Bunu yaparken dokuları çok küçük parçalara ayırmıyorum; sadece toplam boyutu küçültmek istiyorum, böylece disosyasyon işlemini gerçekleştirdiğimde pipet, tüm beyne kıyasla biraz daha küçük parçalar çekebilsin. Ayrıca bunu nispeten hızlı yapmam gerekiyor çünkü gördüğünüz gibi medya damlaları küçük. Bu durum, yüksek bir yüzey-hacim oranına sahip olduğumuz anlamına gelir ve çözeltiyi herhangi bir süre dışarıda bırakırsam hem pH hem de osmolarite değişebilir.Bunu ilk yapmaya başladığımda, aynı anda sadece iki beyin, iki kültür hazırlardım. Şimdi genellikle dört tane yapıyorum ve şu an pipeti kıracağım ama bundan bahsedemem, değil mi? Bunu henüz bitirdim.Disosyasyon için pipet boyutu oldukça uygundu. Dokuyu çekip birkaç kez aşağı yukarı pipetleyebildim; tekil hücreleri görebiliyorsunuz, hala bazı kümeler var ancak bu sorun değil, bunlar yıkama ile temizlenecektir.Şimdi, kültürler ekim işlemi tamamlanır tamamlanmaz ikinci bir Petri kabına yerleştirilir ve pH ile osmolarite seviyelerinin hayatta kalmalarını destekleyecek düzeyde tutulduğundan emin olmak için birkaç dakika içinde CO2 inkübatörüne konur. Böylece, kabı doldurmadan önce onları 30 dakika boyunca burada tutarız. Bu kültürler, geç evre pupaların beyinlerinden hazırlanmıştır.Kültür, bir CO2 inkübatöründe iki gün boyunca büyütülmüştür ve uzanmış uzantılara sahip bireysel hücreleri görebilirsiniz. Uzantı gelişimi, beşinci günde göreceğinizden daha az, birinci günde göreceğinizden ise daha fazladır. Benim adım Jorge Ano.Doubts laboratuvarında çalışıyorum. Şimdi size, az önce hazırladığımız hücre kültürlerinde kalsiyum görüntüleme deneyini nasıl gerçekleştirdiğimizi göstereceğim. Bu, düşük kalsiyum seviyelerini gösteren mavi hücrelerin ve yüksek kalsiyum seviyelerini belirten kırmızı hücrelerin görüldüğü bir kalsiyum görüntüleme deneyi videosudur.Bazı hücrelerin kırmızıya döndüğünü göreceğiz ve bu, hücre içi kalsiyum seviyelerinin arttığını gösterir. Bunlar spontanedir ve geçicidir. Zamanla bazal kalsiyum seviyelerine geri dönerler ve bir süre sonra, bu durumda nikotin olan bir ilaç uygulayacağız ve hücrelerin hücre içi kalsiyum seviyelerini artırdığını göreceksiniz.Nikotini 100 saniye boyunca uyguluyoruz, ardından nikotini uzaklaştırıyoruz ve hücreler tekrar bazal kalsiyum seviyelerine dönüyor. Bu kültür sisteminin gerçek avantajı, kültürlerimizi hem transgenik hem de mutant sinek hatlarından oluşturabilmemizdir; bu hatların her birinde farklı nöron alt popülasyonları GFP ile işaretlenmiştir. Bu, GFP'nin mantar cisimciği Kenyon hücrelerinde, yani öğrenme ve hafıza dahil olmak üzere karmaşık davranışların aracılığında rol oynayan nöronlarda eksprese edildiği kullandığımız hatlardan birine ait beyindir.Hücre gövdeleri, beynin dorsal kısmında, kırmızı okların olduğu bölge civarında yer alır. GFP pozitif olan bu L şeklindeki yapılar ise aslında bu mantar vücut Kenyon hücrelerinin aksonal projeksiyonlarıdır. Bu beyin dokusunun dissosiyasyonundan sonra.Nöronlar kültür ortamında uzantılarını yeniden oluştururlar ve bu durumda GFP pozitif Kenyan hücrelerini kolayca tanımlayabilirsiniz. Bu hücreler, hem standart elektrofizyolojik kayıt hem de kalsiyum görüntüleme çalışmaları için uygundur. Bu nedenle, söz konusu kültürler, yetişkin hayvanlarda karmaşık davranışların aracılığında önemli olduğunu bildiğimiz nöronların fonksiyonlarını düzenlemede etkili olan genetik ve çevresel faktörlerin araştırılması için oldukça kullanışlı araçlardır.

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem...

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Bu video, Drosophila beyin nöral kök hücrelerinin hareketsiz durumlarından yeniden aktivasyonunu başlatan eksojen faktörleri tanımlamak için bir protokol göstermektedir. Yumurtadan yeni çıkmış larvalar beyinlerini izole etmek için parçalara ayrılır ve daha sonra hormonun nöral kök hücre reaktivasyonunu ve proliferasyonunu indükleme potansiyelini değerlendirmek için bir test hormonu olan veya olmayan ortamda kültürlenir.

Kültürlenmiş Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonunun Analizi

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

Drosophila S2 hücreleri ve kültürlenmiş nöronların in vivo olarak motor tahrikli bir organel taşıma görüntüleme için büyük sistemlerdir. Burada, her iki hücre kültür tipleri için, görüntüleme ve taşıma analiz protokolleri ayrıntılı tarif etmektedir.

Kültürlü organel Ulaşım Drosophila Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Bu makale, erişkin Drosophila'ya Penetrasyon Travmatik Beyin Hasarı (PTBI) uygulamak ve ortaya çıkan nörogenezleri incelemek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.

Drosophila Merkezi Beyninde Yetişkin Nörogenezini Uyarmak ve Analiz Etmek

Kültürlü Drosophila beyin eksplantlarında sessiz nöral kök hücreleri yeniden aktive etmek için bir yöntem oluşturulmuştur. Bu yöntem kullanılarak, nöral kök hücre sessizliğinin, giriş ve çıkışın düzenlenmesinde sistemik sinyallerin rolü doku-intrinsik sinyallerden ayrılabilir.

Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu

Öğrenin geç evre Drosophila pupa beyinlerinden primer nöronal kültür hazırlama yöntemini. Merkezi beyin bölgesi yetiştirilerek nörit uzantısı ve kalsiyum görüntüleme ile sinir gelişimi incelenir.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Daha fazla video keşfet