Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Benim adım Diana Dowd ve UC Irvine'de Anatomi ve Nörobiyoloji ile gelişim ve hücre biyolojisi bölümlerinde profesörüm. Bugün size Drosophila Pupi'den nöronal kültürlerin hazırlanmasından bahsedeceğim. Bu, beynin geç evre pupilerden çıkarılmasını içerir ve genellikle sadece merkezi beyin bölgesini kültüre alırız.

Ve bu aşamada, yetişkin beyninde bulunan ana anatomik yapılar zaten oluşmuştur. Bu, aksonlarını mantar vücut bölgesine kadar gönderen projeksiyon nöronlarının bulunduğu anten loblarını ve aksonlarını Alfa, beta ve gama lobları aracılığıyla hedef nöronlarına gönderen mantar vücut nöronlarını, Kenya hücrelerini içerir. Kültür gününde, ilk yaptığımız şey laminer akış başlığına girmek ve dokuyu ayırmak için kullanacağımız enzim solüsyonu olan steril olanı hazırlamak olacaktır.

Ayrıca hücreleri büyütmek için kullanacağımız ortamı da oluşturuyoruz. Ve bu, önceden hazırladığımız saplardan yapılır. Bir sonraki adım, bu ayrışma veya diseksiyon için kullanacağımız yavruyu toplamaktır.

Ve bu, kaputun dışında yapılır çünkü bunlar maya ve her türlü başka şeyi içeren şişelerde yetiştirilir. Ve böylece aslında diseksiyonumuzun ilk aşamalarını kaputun dışında yapıyoruz. Bunlar az önce bir şişenin kenarlarından çıkardığım peepee'ler, ve bu sol sırada kırmızı gözlü hayvanlarımız var ve kültürleme için iyi bir aşama.

Bunlar biraz, buradaki PPP biraz daha genç. Turuncu veya sarı gözleri var ve bu tamam 1 0 7 çizgisi. Normal vahşi türlerden biraz daha parlak gözlere sahiptirler, bu aşamalardaki renk biraz daha kahverengi olacaktır.

Bu aşamaların tümü kültürleme için, insanları beyin kültürleri haline getirmek için iyidir. Tamam, buradaki ilk adım, çıkardığım ve Petri kabıma dizdiğim pupi'nin hemen yanına birkaç damla diseksiyon solüsyonu koymak. 35 milimetrelik Petri kaplarının üst kısımlarını kullanıyoruz.

Daha sonra sol elime bir çift beş numara forseps ve ucunda 27 gauge iğne olan bir CC tüberkülin şırıngası alıyorum. Bunlar benim iki diseksiyon aracım. Ve kafayı göz bebeği kutusundan veya pupiden çıkarmak için, temel olarak i'yi kullanmam gerekiyor, pupi'yi sol elimde forsepsle tutuyorum ve sonra sağ elimdeki iğneyi kullanarak öğrenci kutusunun önünü çıkarıyorum.

Daha sonra kütikül kaplamasını geri çektim ve kafa önden dışarı çıkıyor. Daha sonra iğnemi boyun bölgesindeki I'yi kesmek için kullanıyorum ve kafayı alıp diseksiyon salin damlasına yerleştiriyorum. Bu prosedürü 10 ila 15 kez tekrarlayacağım çünkü iyi bir kültür oluşturmak için her genotipten 10 ila 15 hayvana sahip olmayı seviyorum.

Pekala, hayvanın kafasından beynini çıkaracağım. Bunu yapmak için, her biri 27 gauge iğne tutan iki tüberkülin şırıngası kullanıyorum. Sol iğneyi, kafayı Petri kabının dibine sabitlemek için hayvanın pisisine yerleştiriyorum.

Ve sonra sağ iğnemi kullanarak sağ tarafta bir yarık açıyorum ve beyni dışarı iteceğim yer orası. Tamam, ve ben, bir sonraki adım sol iğnemi sol gözün üzerine koymak. Ve şimdi aslında sadece eski itme yapacağım ve beyin yarıktan sağ taraftan çıkmalı.

İşte geliyor. Sağ tarafta görebilirsiniz ve şimdi sadece sağ iğnemi kullanarak onu kafa kapsülünün geri kalanından ve gözlerden ayırabiliyorum. Tamam. Şimdi, optik lobları çıkarmak olan son diseksiyonu yapmadan önce, beyni temiz bir tuzlu su damlasına aktarıyorum.

Bunu yapmak için bir boru eman kullanabilirim ve onu 20 mikrolitrelik bir boru emanının en ucundan alırım ve beş mikrolitreye ayarlanmış olarak kullanırım, ya da aslında iğnelere de aktarabilirim. Bu, diseksiyon prosedürünün son aşamasıdır. Taze bir damla tuzlu su ile yapılır ve genellikle burada yaklaşık 10 ila 15 beynim olur.

Daha sonra 27 gauge iğneleri kesici alet olarak kullanarak optik lobları her birinden çıkarıyorum, ve sadece sol optik lobu kesiyorum ve sonra her beyindeki sağ optik lobu kesiyorum. Ve bu noktada, bu şekilde işlenen tüm beyinler, enzimatik ayrışma için kullanılacak olan enzim çözeltisini içeren bir tüpe aktarılacaktır. Tek bir genotipten gelen tüm beyinler, enzim çözeltisinin bir değirmenini içeren tek bir epi vidalı kapaklı einor tüpüne konur.

Ve sonra onları bir test tüpü tutucusuna yapıştırıyoruz ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika bekletecekleri bir döndürücüye koyuyoruz. Ve bu, Ayrışmanın gerçek zamanıdır. Enzim ayrışma adımını tamamlamak için aslında enzimi çıkarmamız gerekiyor.

Bu yüzden tüpleri bir EOR santrifüjüne getiriyoruz, tüpleri santrifüje yerleştiriyoruz ve onları 3000 RPM'de üç dakika boyunca döndüreceğiz. Beyinleri döndürdükten sonra, onları şimdi laminer akış başlığımıza getiriyoruz. İşlemin steril kısmının başladığı yer burasıdır.

Artık laminer akış başlığında olmadıkça tüpü açmıyoruz ve şimdi enzim çözeltisini çıkaracağız. Onu diseksiyon solüsyonu ile değiştireceğiz ve sonra hem diseksiyon solüsyonu ile birkaç kez döndürüp yıkayacağız hem de hücreleri büyüttüğümüz Tanımlanmış bir ortam elde edeceğiz. Anlaşıldı.

Burada yapmam gereken ilk şey, bu Petri kaplarında bulunan kapak fişlerinin her birine beş mikrolitrelik bir damla salin koymam gerekiyor. Petri kabı başına tek bir kapak fişi var ve con a laminin ile kaplanmış, bu yüzden kapak fişinin tam ortasına beş mikrolitrelik bir damla koydum. Laminin damlamın olduğu yer orası.

Bu çok önemli çünkü hücrelerinizi alanın tam ortasında yoğunlaştırmak istiyorsunuz çünkü beyin başına yaklaşık 10.000 hücre alıyoruz ve bununla tek bir kültür oluşturuyoruz. Tamam, şimdi mikroskoba baktığımızda, burada enzim ayrıştırma işleminden geçmiş dokuz beyin var. Hala oldukça sağlam olduklarını görebilirsiniz.

Optik lobları yok. Bunlar çıkarıldı, ama sadece merkezi beyin bölgemiz var ve şimdi tek bir beyni pipetleyeceğim ve onu bir kapak fişi üzerindeki beş mikrolitrelik damlaya taşıyacağım. Ve bunu dört kez yapıyorum.

27 gauge iğnelere takılan iki adet bir CC şırınga alıyorum. Yine, bunların çok ucuz ve tek kullanımlık diseksiyon araçları olduğunu not etmek gerçekten önemlidir, bu nedenle lisans öğrencileri bunu bütçeniz hakkında endişelenmeden yapabilirler. Tamam, şimdi elimde iki iğne var ve ilk mekanik ayrışmayı yapacağım, bu beyni birkaç parçaya bölmek, bu da bana bu parçaları bir dakika içinde bir cam pipet içine çekerek son ayrışmayı tamamlamamı sağlayacak.

Bunu yaparken, onları küçük parçalara indirmiyorum, sadece toplam boyutu küçültmeyi artırmak istiyorum, böylece biraz alabilirim, böylece pipet, ayrışma yaptığımda tam beyinden biraz daha küçük parçalar ortaya çıkarır. Ben de bunu nispeten hızlı bir şekilde yapmak istiyorum çünkü medya damlalarının küçük olduğunu görüyorsunuz. Bu, yüksek bir yüzey / hacim oranına sahip olduğumuz ve herhangi bir süre dışarıda bırakırsam çözeltinin hem pH'ı hem de ozmolaritesi değişebileceği anlamına gelir.

Bunu ilk kez yaptığımda, aslında sadece bir seferde iki beyin, aynı anda iki kültür yapardım. Şimdi genellikle dört tane yapıyorum ve şimdi pipeti kıracağım, ama bunun hakkında konuşamam ya da başka bir şey, değil mi? Bunu yeni bitirdim.

Ayrışma, pipetin boyutu oldukça iyiydi. Dokuyu birkaç kez yukarı ve aşağı emmeyi başardım ve tek tek hücreleri ve bunları görebilirsiniz, hala kümelerimiz var, ama sorun değil. Yıkayacaklar.

Şimdi, kültürler, kaplanır kaplanmaz, ikinci bir Petri kabına yerleştiriliyor ve birkaç dakika içinde CO2 inkübatörüne yerleştiriliyorlar çünkü pH'ı ve ozmolariteyi hayatta kalmalarını destekleyecek bir seviyede tuttuğumuzdan emin olmak istiyoruz. Bu yüzden tabağı su basmadan önce onları 30 dakika burada tutuyoruz. Bu kültürler geç evre pupilerin beyinlerinden hazırlandı.

Kültür, bir CO2 inkübatörde iki gün boyunca büyütüldü ve uzun süreçlere sahip tek tek hücreleri görebilirsiniz. Süreç detaylandırmanın kapsamı, beş günde göreceğinizden daha az ve bir günde göreceğinizden daha fazladır. Benim adım Jorge Ano.

Şüpheler laboratuvarında çalışıyorum. Şimdi size deneyi nasıl yaptığımızı göstereceğim, yeni hazırladığımız insan kültürlerinde kalsiyum görüntüleme deneyini. Bu, düşük kalsiyum seviyelerini gösteren mavi hücrelerin ve yüksek kalsiyum seviyelerini gösteren kırmızı hücrelerin görüldüğü bir kalsiyum görüntüleme deneyinin videosudur.

Kırmızıya dönen bazı hücreler olduğunu göreceğiz ve bu, hücre içi kalsiyum seviyelerinin arttığını gösteriyor. Ve bunlar kendiliğindendir ve bunlar geçicidir. Zamanla Baal kalsiyum seviyelerine geri dönerler ve bir süre sonra bir ilaç uygulayacağız, bu durumda nikotin ve hücrelerin hücre içi kalsiyum seviyelerini artırdığını göreceksiniz.

100 saniye boyunca nikotin uyguluyoruz, sonra nikotine dikkat ediyoruz ve sonra hücreler bazal kalsiyum seviyelerine geri dönüyor. Bu kültür sisteminin gerçek avantajı, kültürlerimizi hem transgenik hem de mutant sinek soylarından, farklı nöron alt popülasyonlarının GFP ile etiketlendiği farklı sinek soylarından yapabilmemizdir. Bu, GFP'nin mantar gövdesinde, Kenya hücrelerinde, öğrenme ve hafıza da dahil olmak üzere karmaşık davranışlara aracılık eden nöronlarda ifade edildiği kullandığımız hatlardan birinin beynidir.

Hücre gövdeleri, beynin dorsal kısmında, kırmızı okların bulunduğu bölgenin çevresinde bulunur. Ve GFP pozitif olan bu L şeklindeki yapılar aslında bu mantar gövdeli Kenya hücrelerinin aksonal çıkıntılarıdır. Bu beyin dokusunun ayrışmasından sonra.

Nöronlar kültürdeki süreçlerini yeniler ve bu durumda GFP pozitif Kenya hücrelerini kolayca tanımlayabilirsiniz. Bunlara hem standart elektrofizyolojik kayıt hem de kalsiyum görüntüleme çalışmaları için erişilebilir. Bu nedenle, bu kültürler, Yetişkin hayvanlarda karmaşık davranışlara aracılık etmede önemli olduğunu bildiğimiz nöronların işlevini düzenlemede önemli olan genetik ve çevresel faktörleri keşfetmek için gerçekten yararlı araçlardır.