Name: Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Keşfedin metagenomik kütüphanelerden 10.000 koloniyi membran filtreler üzerine robotik sistemlerle inokülasyon yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal toplulukların yüksek doğrulukla incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hibridizasyon prosedürü Bir hibridizasyon tüp 1 veya 2 membranlar (22 cm boyutu 22) alacak. Hibridizasyon karışımı 50 ml ve 0.5 mg DNA prob hibridizasyon tüp başına (10 ng / ml son konsantrasyon) kullanın. En iyi sonuç için, jel-saflaştırılmış DNA prob olarak kullanın. Prob hazırlanması ölçeklendirme, tüpler numarası yerine tüp başına reaktiflerin miktarını artırarak artar. Probe hazırlık (0.5 mg DNA): <ol><li> Su 60 ul ile 15 ul çapraz bağlayıcı çözüm sulandırınız. </li><li> DNA 10 ng / vidalı kapaklı bir mikrotüp 50 ul toplam hacmi su ile ul seyreltilir. </li><li> Kaynar suda 5 dakika denatüre DNA. </li><li> Hızla buz transferi ve 5 dakika soğumasını bekleyin. Kısaca Spin. </li><li> 50 ul reaksiyon tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 10 ul etiketleme reaktif ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 50 adım 1 seyreltilmiş çapraz bağlayıcı bir çözüm ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. Yavaşça vorteksleyin ve kısaca döndürün. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 2 saat kadar buz tutunuz veya -20 ° C&#39;de% 100 gliserol ve mağaza eşit hacimde Not: kit ile birlikte su kullanın. Aksi belirtilmedikçe bütün reaktifler buz üzerinde tutun. </li></ol> Membran hazırlama ve hibridizasyon <ol><li> Hibridizasyon tamponu ve hibridizasyon tüp Onceden 60 ila 50 ml ° C </li><li> Hibridizasyon tüp hibridizasyon tamponu ekleyin. Membran (ler) Rulo ve hibridizasyon tüp ekleyin. (Tüp başına 2 membranlar, tamamen bir membran kadar ilk rulo eklenirse, o zaman aynı yönde diğer membran üst döndürün.) </li><li> Inkübe hibridizasyon tüp, 60 ° C, en az yarım saat (Membran (ler) iyice ıslatılmış aldığınızdan emin olun.) </li><li> Hibridizasyon tüp tüp etiketli prob içeren uzun bir pipet ile hibridizasyon tamponu yaklaşık 1 ml aktarın. Yavaşça vorteksleyin ve kısaca döndürün. Hibridizasyon tüpe geri karışımı aktarın. </li><li> 60 ° C gece inkübe edin. Not: Kullanım forseps ve eldiven membranlar işleme. Hibridizasyon tüplerin Mix içerik nazikçe, çünkü çok fazla ajitasyon istenmeyen köpük kalıcı oluşumuna sebep olacaktır. Membranlar ıslak durumda eklenmelidir; hibridizasyon gerekirse tampon ya da su ile ıslatın ve aşırı sıvı eklemeden önce boşaltın. </li></ol> 2. Algılama prosedürü Yıkama membranlar <ol><li> 60 ° C&#39;ye ısıtın birincil yıkama tamponu (Mikrodalga fırın ve / veya ısıtma plakası kullanın.) </li><li> Bir melezleşme tüp 2 membranlar varsa, bir membran temiz, önceden ısıtılmış, boş hibridizasyon tüp transferi. </li><li> Kısaca temel yıkama tamponu yaklaşık 50 ml hibridizasyon tüp durulayın. </li><li> 60 hibridizasyon tüp ve inkübe ° C de 10 dakika süreyle birincil yıkama tamponu yaklaşık 100 ml ekleyin. </li><li> 3. ve 4. adımı yineleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında en az 250 ml orta yıkama tamponu ile konteyner ve inkübe yıkama membran aktarın. </li><li> 6. adımı tekrarlayın. Not: Membranlar sinyal nesil önce yarım saat kadar, oda sıcaklığında ikincil yıkama tamponu muhafaza edilebilir . </li></ol> Sinyal üretimi ve algılama (bir membran prosedürü) <ol><li> Masaüstü üzerine SaranWrap düz Bant iki adet (2 için bir adım ve bir adım 4). </li><li> Kabın kenarına membran köşelerine dokunarak membran aşırı tampon dikkatlice boşaltın ve SaranWrap üzerine (kadar örnek tarafı) membran transfer. </li><li> Membran ve membran üzerinde kat Saran wrap üzerinde ECF reaktif 6-7 ml dökün. Membran üzerinde dikkatlice SaranWrap üzerinde Kimwipe hafifçe hareket ettirerek ECF reaktif dağıtın. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Membran fazla ECF reaktif boşaltın ve üzerine yeni SaranWrap, membran üzerinde kat sarın, transferi ve bant ile kenarları mühür. Membran alüminyum folyo ile örtün. 1-2 saat inkübe edin. </li><li> ECF reaktif 1-2 ml cam plaka üzerinde dağıtarak tarayıcı cam plaka hazırlayın. Daha sonra cam plaka üzerine membran (aşağı örnek tarafı) transferi ve ECF reaktif membran üzerinde başka bir 1-2 ml dağıtmak. SaranWrap Yerleşimi ve membran uzak dikkatle tüm hava kabarcıkları itin. (SaranWrap üstüne bir cam levha karşı bastırdı zar tutmak için sert plaka koyabilir.) </li><li> Uyarma 473 nm, algılama filtresi LPB (510 nm), çözünürlük 50 mikron, 16-bit sinyal mezuniyet, CH1 400 V. (Tarama: Aşağıdaki ayarları ile Fuji FLA-5100 floresan tarayıcı (&quot;1 lazer 1 resim&quot; modu) kullanın. 22 cm boyutu 22 membran başına yaklaşık 15-20 dakika sürer.) İsteğe bağlı: </li><li> 2-4 saat (veya daha uzun) bekletin. </li><li> 6. adımı olduğu gibi tarama işlemi tekrarlayın. </li></ol> 3. (Nufkullanıcısının versiyon) Dekapaj ve prosedür depolama <ol><li> % 100 ve membran aktarınyavaşça sallanarak 10 dakika oda sıcaklığında hanol ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Taze% 100 etanol ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir gece inkübe. (Membran birkaç gün etanol içinde kalır.) </li><li> Distile su ile etanol değiştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> SDS (son% 0.5 SDS) bir melezleşme tüp, 100 ml su ve 5 ml% 10 ekleyin ve hafifçe karıştırın. Membran ekleyin. </li><li> 80 ° C 1 saat inkübe </li><li> Temiz, boş konteyner membran aktarın. </li><li> % 10 SDS 500 ml su ve 5 ml (final% 0.1 SDS) güçlü bir mikrodalga fırın kaynatmak için bir beher ve ısı ekleyin. </li><li> Yakın kaynar% 0.1 SDS çözümü membran üzerine dökün ve hafifçe birkaç dakika için ajitasyon. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> En az 10 dakika süreyle en az 250 ml steril 100 mM Tris, pH 8 durulayın. </li><li> Wrap SaranWrap membran ve bant ile dikkatlice yakın kenarları. 4 ° C saklayınız (Membranlar kurumasına asla gerekir.) </li></ol>

Soyma işlemi optimize edilmemiştir. Ancak, üreticinin talimatı (2 yıkar, her biri 10 dakika, 1 saat 60 ° C &#39;de% 0.5 SDS% 100 etanol içinde 1 yıkama) verilen soyma işlemi yetersizdir. Gecede en az% 100 etanol inkübasyon ECF reaksiyon ürünü çözmek için gereklidir;% 100 etanol birkaç gün kuluçka membran reprobe yeteneği üzerinde hiçbir olumsuz etkisi var gibi görünüyor. Ayrıca üretici SDS tedavi yetersiz görünüyor. Nufkullanıcısının 80 1 saat çalıştı ° C,% 0.5 &#39;SDS bir tedavi ile başarı ile yakın kaynar% 0.1 SDS izledi. Tracy yakın kay...

Kombinasyon paketi RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

metagenomic kütüphaneler büyük Ölçekli ekranlar

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic kütüphanelerde arşiv önce ekimi gerektirmeden mikroorganizmalardan bitişik genomik dizilerinin büyük parçaları. Metagenomic kütüphaneler oluşturulması ve tarama için akıcı bir prosedür oluşturma kültürsüz mikrobiyal topluluklarının genetik ve metabolik özelliklerini içine verimli, yüksek verimli araştırmalar için yararlıdır. Burada, anahtar protokolleri, dönüşümlü olarak robotik enstrümantasyon ve (insan) manuel müdahaleler bağlıdır uzun bir süreç doğru bir şekilde tanımlamak için en yararlı biçimde. Öneriyoruz video sunulmaktadır. Birincisi, biz, yirmi dört 384-iyi kütüphane plakalar yinelenen koloniler içerebilir, her biri yüksek yoğunluklu macroarray membranlar üzerine kütüphane klonlar, nokta robotik istihdam. Otomasyon da çok yoğun mekansal düzenlemeler, çok sayıda kütüphane klonların sığdırmak için gerekli ölçek minyatürleştirme nedeniyle hassasiyet ve hız için sadece bu işlem için gerekli, ancak. Bir kere üretilen, önümüzdeki macroarray membranlar prob etiketleme, membran hibridizasyon ve sinyal tespiti için standart protokoller değiştirilmiş sürümlerini kullanarak ilgi genlerin nasıl gösterildi gösterdi. Biz online video yanında tüm bunların ayrıntılı bir yazılı ilgili adımları açıklamaları ve gerekli malzemeler, görsel bir gösteri ile bu işlemler tamamlanmaktadır.

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomik kütüphaneler, önceden kültüre etme gereksinimi duymadan, mikroorganizmalardan elde edilen ardışık genomik dizilerin büyük fragmanlarını arşivler. Bir ... oluşturmak...

Buradaki amacımız, bu metagenomik kütüphanelerin bazılarından elde edilen kolonileri membran filtrelere ekmektir ve bu filtrelerin her biri 10.000 koloni taşıyabilir. Şu an yaptığım işlem, bu naylon filtreyi bir blok üzerine yerleştirmek ve düzeltmektir. Filtre, az miktarda sıvı içerisinde, yani sadece büyüme ortamı olan luria broth içerisindedir.Ardından, nemlendirilmiş bu membranı, membranı otomatik olarak 10.000 koloni ile ekleyecek olan robota transfer edecek. Bu tür bir prosedür için robotik sistemler gereklidir çünkü hiçbir insanın, bu membranlardan birine 10.000 koloniyi noktalayacak sabrı veya hassasiyeti yoktur. Robotlar, çok tekrarlayan ve küçük mekânsal ölçekli işlemlerin yüksek doğrulukla yapılmasına olanak tanıyarak genom bilimini aslında ileriye taşıyan unsurlardan biridir.Şu anda, robot bu 3 adet 84 kuyucuklu plaka ile besleme işlemini gerçekleştirmek üzere hazırlanıyor; bu 3 adet 84 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğu, Metagenomic kütüphanesinden gelen münferit bir koloni içermektedir. Şu anda robot, membrana spotlama yapmak için kullanacağı ekim iğnelerini sterilize ediyor. İğneler, biri %70 ethanol olan ve sterilizasyon sağlayan birkaç farklı çözeltiden geçiyor; a

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Kaynak: Kim, H. ve ark., Yüksek verimli Genetik Enzim Tarama Sistemi Kullanarak Çok Enzimli Tarama. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, metagenomik fosmid kütüphaneleri ve kromojenik substratlar kullanılarak enzim ifadesini tespit etmek için genetik tarama yöntemini göstermektedir. Akış sitometrisi, renkli ürünler üreten tek hücreleri tanımlar ve izole eder; böylece aktif enzim eksprese eden hücrelerin yüksek verimlilikte seçimini sağlar.

Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Silajlık sığır yemlerinin mikrobiyomunu araştırmak için Metagenomik kullanılmıştır. Analiz, av tüfeği dizilimi ile gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, sığır yemi içindeki mikrobiyal topluluğun bileşimini karakterize etmek için kullanılmıştır.

Yemlerin metagenomic Analizi

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Keşfedin metagenomik kütüphanelerden 10.000 koloniyi membran filtreler üzerine robotik sistemlerle inokülasyon yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal toplulukların yüksek doğrulukla incelenmesini sağlar.

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Daha fazla video keşfet