Name: Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Öğrenin, optik tuzak kullanarak E. coli hücrelerinin bükülme rijitliğini ölçme yöntemini. Bu protokol, bakteri hücre mekaniğini ve iç yapıların mekanik bütünlüğe katkılarını incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mingzhai Sun yüzeylere bağlayıcı hücreleri üzerinde yararlı öneriler kabul etmiş sayılırsınız. Ned Wingreen ve Zemer Gitai değerli tartışmalar için teşekkür ederim. Bu araştırma Ulusal Sağlık hibe P50GM07150 Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödül FİZ-0.844.466 ve Alfred P. Sloan Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li> Luria Beltrani suyu (LB) orta üstel faz (OD = 0.2-0.4), E. coli hücreleri büyütün. </li><li> Ipliksi büyüme ikna etmek için 15 dakika süreyle 50 mcg / ml sefaleksin ile desteklenmiş LB kültür büyür ve sonra kültür santrifüj yoluyla 5 kez konsantre. </li><li> % 1 polyethylenimine bir akış odasına su içinde seyreltilmesi akan PEI kaplı lamel olun ve 5 dakika inkübasyondan sonra su ile yıkayın. </li><li> Odasına konsantre hücre kültürü akışı ve unattached hücreleri çıkarmak için 3 dakika sonra LB ve sefaleksin (50μg/mL) karışımı ile yıkanır. </li><li> ° C 37 ° odasına inkübe bağlı hücreleri optik yakalama aracı yerleştirmeden önce büyümesine izin için 30 dakika-1 saat. </li><li> 30 dakika su içinde seyreltilmesi% 0,1 polylysine 0,5 mikron çap polistiren boncuklar (Kaküller Labs) kuluçka polylysine kaplı boncuklar olun. Sonra boncuk, 3 kez yıkayın ve su tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Sefaleksin (50μg/mL) LB içine iki faktör tarafından boncuk çözeltinin ve akışını odasının içine ekleyin. </li><li> Optik kayan boncuk tuzak ve bir hücrenin serbest ucu dokunma. (Örnek hareket kontrol Mad City Labs piezo sahne kullanın.) Uygun bir hücre / boncuk birleşimi bulunduğunda, LB (50μg/mL) unattached boncuk kaldırmak için odasına sefaleksin ile yıkayın. </li><li> Hücre ve kayıt kuvvet-deplasman veri bükme güçleri uygulamak için özel yazılmış LabView programını çalıştırın. Program Ayrıntıları <ol class="lalpha"><li> Raster algılama lazer ışını ve kayıt 3D PSD gerilim sinyalleri içinde ekli boncuk tarama dedektörü yanıt kalibre edin. </li><li> Mikroskop görüntü hücre uzun ekseni belirleyin. </li><li> Hücrenin uzun eksenine dik yönde adımlar hücre taşıyın. </li><li> Optik tuzak uzaklık taşındı ve deplasman kaydedin. </li><li> Önce ölçülen tuzak sertlik kullanılarak uygulanan kuvvet deplasman dönüştürme ve uç deplasman ve kuvvet dosyayı kaydedin. </li></ol></li></ol> Başarı Sırları: Adım 8), biri iyi tanımlanmış sıkışmış sonu ile bir hücre bulmak zorundadır. Bazı hücreler sadece bir ucu, diğer ucunda ve bükme kuvveti sıkışmış bir bütün hücre dönme yerine bükme yol açar. Uygun çifti, her hücre joystick kontrollü sahne hareket kullanarak elle hızlı bükerek bulunur. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1: Bu rakam tek bir hücre için kuvvet-deplasman verileri gösterir. Bu çizginin eğimi hücre bükme sertlik.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

Bu makalenin video prodüksiyon, bu çalışmalarda kullanılan aletler üreten Mad City Labs tarafından sponsor oldu.

Burada sunulan protokol kantitatif bakteri hücrelerinin bükme özellikleri ölçmek için tasarlanmıştır. Deneme kurulum filamentously büyümeye yapılabilir herhangi bir çubuk şekilli hücre uygulanabilir. Biz başarıyla E. bükülme sertliği sitoskeletal filamentler etkileri prob Bu kurulum coli hücrelerinde. Bu aynı teknikle hücre genel eğilme sertliği belirlenmesinde basıncı, hücre duvarı sertliği ve diğer hücre içi bileşenlerinin rollerini değerlendirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>sefaleksin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polilizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0.5-&amp;mu;m çaplı polistiren boncuklar</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Nano-LP Serisi nano konumlandırma sistemi</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

optik tuzak kullanarak bakteriyel hücre bükme rijitlik Ölçüm

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Ipliksi çubuk şekilli bakteriler bükme sertliği ölçmek için bir protokol geliştirmiştir. Kuvvetleri, optik bir tuzak, bir yüksek yoğunluklu lazer ışını mikroskop objektif lens ile çok küçük bir noktaya odaklanmış oluşan ışık mikroskobik üç boyutlu bahar ile uygulanır. Bir hücre viraj için, öncelikle bir kimyasal işlem görmüş lamel canlı bakteri bağlama. Bu hücreler büyüdükçe, hücrelerin orta lamel bağlı kalır, ancak artan biter bu kısıtlama. Ilaç sefaleksin ile ipliksi büyümeyi teşvik ederek, diğer ucunu bükme güçleri unattached ve duyarlı kalırken hücrenin bir ucundan yüzeye yapışmış olan hücreler tespit edebilmek. Bükme kuvveti sonra büyüyen bir hücre ucu polylysine kaplı boncuk bağlayıcı bir optik tuzak ile uygulanır. Kuvvet ve boncuk yerinden her ikisi de kaydedilir ve hücre eğilme sertliği, bu ilişkinin eğimi.

Biz hücresel bükülme sertliği ölçmek için bir optik tuzak bir kapak kayma yüzeyi bağlı bükme ipliksi bakteri hücreleri için bir protokol mevcut.

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

Filamanöz çubuk şekilli bakterilerin bükülme rijitliğini ölçmek için bir protokol geliştirdik. Kuvvetler, mikroskobik bir... olan optik bir tuzak ile uygulanır.

Tekil E. coli hücrelerinin bükülme rijitliğini belirlemek için, önce bakterileri eksponansiyel fazda büyütün ve ardından onları kimyasal olarak işlem görmüş bir lamel yüzeyine tutturun. Yüzeye tutunmuş olan hücrelerin, esnek uçlar geliştirecek şekilde daha fazla büyümesine izin verin. Ardından, dielektrik boncuklar akıtın, bir boncuğu yakalayın ve onu bir hücrenin esnek ucuna doğru bükün.Prosedürün son adımı, hücreyi optik tuzakla bükmek ve ortaya çıkan zorlanmış yer değiştirme verilerini ölçmektir. Hücrenin bükülme sertliği, zorlanmış yer değiştirme verilerine uygulanan doğrusal bir uyumla hesaplanabilir. Merhaba, ben Princeton Üniversitesi'ndeki Louis Sickler İntegratif Genomik Enstitüsü ve Fizik Bölümü'nde yer alan Profesör Joshua Shere'in laboratuvarından Steven Wong.Bugün size, bireysel eko hücrelerin bükülmesi ve hücre sertliğinin ölçülmesi prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, farklı hücre içi yapıların bakteri hücrelerinin mekanik bütünlüğüne olan katkılarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, herhangi bir e coli hücresinin üç mililitresini LB besiyerinde eksponansiyel faza kadar büyütün. Hücreler 600 nanometrede 0,2 ile 0,4 arasında bir optik yoğunluğa ulaştığında, filamentöz büyümeyi indüklemek için kültürü 15 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrogram sefaleksin ile destekleyin. Bu 15 dakikalık süre boyunca bir akış odası hazırlayın.İki parça çift taraflı bandı, aralarında üç milimetrelik bir boşluk kalacak şekilde bir lam üzerine yapıştırın ve üzerine bir lamel sabitleyin. Bant parçaları arasındaki boşluk, sıvı akışı için bir kanal oluşturur. Bir mikro pipet yardımıyla akış odasına 10 µL suda seyreltilmiş %1 polyethaline akıtarak lamelin PEI ile kaplanmasını sağlayın ve beş dakika inkübe edin.Ardından, odacığın bir ucundan 200 µL su akıtarak yıkayın ve diğer uçtan vakumla toplayın. Bakterileri sefaleksin varlığında 15 dakika büyüttükten sonra, bir mililitre hücreyi mikro santrifüjde çöktürün ve sefaleksin içeren 200 µL LV içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, yine bir uçta mikro pipet ve diğer uçta vakum kullanarak, konsantre hücre kültüründen 50 µL'yi kaplamalı lamelle tutulan odacığa akıtın ve üç dakika boyunca inkübe edin.Ardından, sefaleksin takviyeli 50 µL Vel B ile yıkayın. Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için, hücreler inkübe edilirken optik tuzaklama cihazına yerleştirmeden önce, yapışmış hücrelerin büyümesine izin vermek amacıyla hazneyi 37 °C'de 30 dakika ile bir saat arasında inkübe edin. 0,5 µm çapındaki polistiren boncukların 3 µL'sini, suda seyreltilmiş %0,1 Polylysine içinde 30 dakika inkübe ederek poli-lizin kaplı boncuklar hazırlayın.Boncukların inkübasyonu tamamlandığında, mikro santrifüjde çöktürerek ve bir mililitre su içinde yeniden süspanse ederek üç kez yıkayın, ardından boncukları bakterilere bağlayın ve hücrelerin bağlanma sertliğini ölçün. Bu protokolün en zor yönü, bükülme sertliği ölçümleri için uygun bir hücreyi tespit edebilmek, konumlandırmak ve tanımaktır. Uygun bir hücre, belirgin bir sabit uca ve serbest uca sahip olan hücredir.Mikroskop üzerindeki akış odasında, belirgin bir şekilde sabitlenmiş ucuna sahip bir hücre arayın. Bazı hücreler sadece tek bir uçtan yapışmıştır ve diğer uçtaki bükülme kuvveti, hücrenin bükülmek yerine bir bütün olarak ekseni etrafında dönmesine neden olur. Uygun bir hücre bulmak için, joystick kontrollü tabla hareketini kullanarak her hücreyi optik cımbızla hızlıca bükün.Uygun bir hücre bulunduğunda, boncuk çözeltisini sefalezin içeren LB içerisinde iki kat seyreltin; boncuk çözeltisinin 30 µL'sini, bir uçtan pipetleyerek ve diğer uçtan bir Kim wipe mendil ile nazikçe akıtarak akış odasına ekleyin. Yüzen bir boncuğu optik tuzakla yakalayın ve onu hücrenin serbest ucuna dokundurun. Yapışmamış boncukları uzaklaştırmak için odayı mikropipet ve 50 µL sefalezin içeren LB ile bir Kim white mendil kullanarak tekrar yıkayın. Ardından, hücreye bükme kuvvetleri uygulamak ve zorlanmış yer değiştirme verilerini kaydetmek için özel olarak yazılmış bir LabVIEW programını çalıştırın.İlk olarak, tespit lazer ışını içindeki ekli boncuğu RA taraması yaparak detektör yanıtını kalibre edin ve 3D PSD voltaj sinyallerini kaydedin. Ardından, bir mikroskop görüntüsünde hücrenin uzun eksenini belirleyin. Uzun hücre ekseni belirlendikten sonra, hücreyi uzun eksene dik bir yönde adımlarla hareket ettirin; hücreyi hareket ettirirken kat edilen mesafeyi ve boncuğun optik tuzak merkezinden olan yer değiştirmesini kaydedin.Son olarak, daha önce ölçülen tuzak sertliğini kullanarak yer değiştirme değerlerini uygulanan kuvvete dönüştürün ve kaydedin. Buradaki dosyaya kaydedilen uç yer değiştirmesi ve kuvvet verileri, tek bir hücreye ait zorlanmış yer değiştirme verileridir. Bu doğrunun eğimi, hücrenin eğilme sertliğidir.E. coli'nin eğilme sertliğini bir optik tuzakla nasıl birleştireceğinizi size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, belirgin bir sabit ucu ve serbest ucu olan uygun bir hücre bulmayı hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

measuring-bending-stiffness-bacterial-cells-using-an-optical

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Seçilen dielektrik mikropartiküllerin havada fırlatılması ve kararlı bir şekilde yakalanması için bir protokol sunulmaktadır.

Havada Dielektrik mikropartiküllerin Optik Tuzak Yükleme

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Biz Optik cımbız hafif levha mikroskop ve hücre mekaniği Drosophila embriyo boncuklar olmadan soruşturma için uygulanması için birleştiğinde bir kurulumu mevcut.

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, hücrelerin reolojik özelliklerini ölçmek için optik cımbız ve defokus mikroskobuna dayanan entegre bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, değişken fizyo-patolojik koşullar altında eritrositlerin viskoelastik özelliklerinin incelenmesinde geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Kırmızı Kan Hücrelerinin Viskoelastik Özelliklerinin Optik Cımbız ve Bulanıklaştırma Mikroskobu Kullanılarak Kantitatif Analizi

Aktomiyozin demetlerinin in vitro oluşumu ve optik cımbız kullanılarak miyozin topluluk kuvveti oluşumunun ölçülmesi sunulmuş ve tartışılmıştır.

Optik Cımbız Kullanarak Aktin Filament Demetlerinde Myosin Topluluk Mekaniğinin İncelenmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Öğrenin, optik tuzak kullanarak E. coli hücrelerinin bükülme rijitliğini ölçme yöntemini. Bu protokol, bakteri hücre mekaniğini ve iç yapıların mekanik bütünlüğe katkılarını incelemek için değerlidir.

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

Daha fazla video keşfet