Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

Tek tek coli hücrelerinin eğilme sertliğini belirlemek için, önce bakterileri üstel faza kadar büyütün ve daha sonra bunları kimyasal olarak işlenmiş bir örtü kayma yüzeyine yapıştırın. Zaten yüzeye yapışan hücrelerin daha da büyümesine izin verin, böylece esnek uçlar geliştirirler. Dielektrik boncuklarda daha sonraki akış, bir boncuğu yakalayın ve bir hücrenin esnek ucuna bükün.

Prosedürün son adımı, hücreyi optik tuzak ile bükmek ve elde edilen zorlanmış yer değiştirme verilerini ölçmektir. Hücrenin eğilme sertliği, zorlanmış yer değiştirme verilerine doğrusal bir uyum ile hesaplanabilir. Merhaba, ben Louis Sickler Bütünleştirici Genomik Enstitüsü ve Princeton Üniversitesi Fizik Bölümü'nde Profesör Joshua Shere'in Laboratuvarı'ndan Steven Wong.

Bugün size tek tek eko hücreleri bükme ve evlenen hücre sertliğini gösterme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, farklı hücre içi yapıların bakteri hücrelerinin mekanik bütünlüğüne katkılarını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu işleme başlamak için, LB ortamında üstel faza kadar herhangi bir e coli hücresinin üç mililitresini büyütün. Hücreler 0.2 ile 0.4 arasında 600 nanometrede bir optik yoğunluğa ulaştığında, filamentli büyümeyi indüklemek için kültürü 15 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrogram sefaleksin ile destekleyin. Bu 15 dakika boyunca bir akış odası yapın.

Parçalar arasında üç milimetre boşluk olacak şekilde iki parça çift taraflı bandı bir cam sürgüne yapıştırın ve üstüne bir kapak fişi bantlayın. Bant parçaları arasındaki boşluk, sıvının akması için bir kanal oluşturur. Su içinde seyreltilmiş 10 mikrolitre %1 polietanleni bir mikro pipet inkübe ederek akış odasına beş dakika inkübe ederek kapak fişini PEI ile kaplayın.

Daha sonra haznenin bir ucunda 200 mikrolitre su akıtarak ve diğer ucunda vakumla toplayarak yıkayın. Bakterileri sefaleksin varlığında 15 dakika büyüttükten sonra, bir mikro santrifüjde bir mililitre hücreyi döndürün ve sefaleksin ile 200 mikrolitre LV'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, yine bir uçta bir mikro pipet kullanın ve diğer ucunda vakumla 50 mikrolitre konsantre hücre kültürünü, kaplanmış kapak kayma inkübatını üç dakika boyunca tutan hazneye akıtın

Daha sonra sefaleksin ile takviye edilmiş 50 mikrolitre Vel B ile yıkayın. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için, hücreler inkübe edilirken optik yakalama aletine yerleştirmeden önce bağlı hücrelerin büyümesine izin vermek için odayı 37 santigrat derecede 30 dakika ila bir saat inkübe edin. Polilisin kaplı boncukları, 30 dakika boyunca suda seyreltilmiş %0.1 Polilizin'den birinde üç mikrolitre 0.5 mikrometre çapında polistiren boncuklar inkübe ederek hazırlayın.

Boncuklar inkübe etmeyi bitirdiğinde, bir mikro santrifüjde döndürerek ve bir mililitre suda tekrar süspanse ederek üç kez yıkayın, boncukları bakterilere bağlamaya devam edin ve hücrelerin bağlanma sertliğini ölçün. Bu protokolün en zor yönü, eğilme, sertlik ölçümleri için iyi bir hücreyi yeniden ayarlayabilmek, bulabilmek ve tanıyabilmektir. Ve iyi bir hücre, iyi tanımlanmış bir sıkışmış ucu ve serbest uç Yeri olan bir hücredir.

Mikroskop üzerindeki akış odası, iyi tanımlanmış bir sıkışmış uca sahip bir hücre arar. Bazı hücreler sadece bir uçta tutturulur ve diğer uçtaki bükülme kuvveti, bükülmek yerine tüm hücrenin dönmesine yol açar. Uygun bir hücre bulmak için, joystick kontrollü sahne hareketini kullanarak her hücreyi tuzak ile hızlı bir şekilde bükün.

Uygun bir hücre bulunduğunda, boncuk çözeltisini sefaleksin ile lb'ye iki kat seyreltin, bir ucuna pipetleyerek ve diğer ucunda bir Kim mendil dokusu ile hafifçe akıtarak akış odasına 30 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin, yüzen bir boncuğu optik olarak yakalayın ve bir hücrenin serbest ucuna dokunun. Hazneyi tekrar mikropipet ile yıkayın ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için LB'de 50 mikrolitre sefaleksin içeren bir Kim beyaz doku kullanın. Ardından, hücreye bükme kuvvetleri uygulamak ve zorla yer değiştirme verilerini kaydetmek için özel bir yazılı laboratuvar görünümü programı çalıştırın.

İlk olarak, algılama lazer ışını içindeki ekli boncuğu RA tarayarak ve 3D PSD voltaj sinyallerini kaydederek dedektör yanıtını kalibre edin. Daha sonra bir mikroskop görüntüsünde hücrenin uzun eksenini tanımlayın. Uzun hücre eksenini belirledikten sonra, hücre kaydını hareket ettirirken hücreyi uzun eksene dik bir yönde adım adım hareket ettirin, taşınan mesafe ve boncuğun optik tuzağın merkezinden yer değiştirmesi.

Son olarak, daha önce ölçülen tuzak sertliğini kullanarak yer değiştirme değerlerini uygulanan kuvvete dönüştürün ve kaydedin. Buradaki uç yer değiştirmesi ve dosyalama kuvveti, tek bir hücre için zorunlu yer değiştirme verileridir. Bu çizginin eğimi, hücrenin eğilme sertliğidir.

Az önce size e coli'nin bükülme sertliğini optik bir tuzakla nasıl birleştireceğinizi gösterdik. Bu prosedürü kullanırken, iyi tanımlanmış bir sıkışmış ucu ve serbest ucu olan iyi bir hücre bulmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.