Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

- Başlamak için, S bazal ortam içeren kültür şişelerini kontrol etmek ve test etmek için karbenisilin ve bir milimolar IPTG ekleyin. L1 larvaları olarak da adlandırılan birinci büyüme aşamasında larva içeren bir tüpü birkaç dakika döndürün. Şimdi süpernatanı çıkarın ve iki mikrolitre L1'i bir agar plakasına yerleştirin. Plakayı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve larva sayısını sayın.

Spesifik olmayan bir RNAi plazmidi taşıyan RNAi bakterilerini kontrol şişesine ve gen hedefli RNAi'li bakterileri test şişesine ekleyin. Eklenen bakteri miktarı solucan sayısı ile orantılı olmalıdır.

Uygun oksijenasyonu sağlamak için larvaların sürekli çalkalama ile büyümesine izin verin. Larvalar bakterilerle beslenir. Larvanın içinde, enterferans yapan küçük RNA, hedeflenen gen tarafından üretilen tamamlayıcı mRNA'ya bağlanır ve protein ekspresyonunu inhibe eder. Son olarak, ilgilendiğiniz fenotip için solucanları inceleyin.

Örnek protokolde, L1 larvalarını sıvı kültürde daf-2 genini hedef alan RNAi ile tedavi edeceğiz.

- Tedaviye başlamak için, 2.800 mililitrelik bir Fernbach kültür şişesine ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ek reaktiflerle birlikte 207.45 mililitre S bazal ortamı