Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

- Başlamak için, S bazal ortam içeren kültür şişelerini kontrol etmek ve test etmek için karbenisilin ve bir milimolar IPTG ekleyin. L1 larvaları olarak da adlandırılan birinci büyüme aşamasında larva içeren bir tüpü birkaç dakika döndürün. Şimdi süpernatanı çıkarın ve iki mikrolitre L1'i bir agar plakasına yerleştirin. Plakayı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve larva sayısını sayın.

Spesifik olmayan bir RNAi plazmidi taşıyan RNAi bakterilerini kontrol şişesine ve gen hedefli RNAi'li bakterileri test şişesine ekleyin. Eklenen bakteri miktarı solucan sayısı ile orantılı olmalıdır.

Uygun oksijenasyonu sağlamak için larvaların sürekli çalkalama ile büyümesine izin verin. Larvalar bakterilerle beslenir. Larvanın içinde, enterferans yapan küçük RNA, hedeflenen gen tarafından üretilen tamamlayıcı mRNA'ya bağlanır ve protein ekspresyonunu inhibe eder. Son olarak, ilgilendiğiniz fenotip için solucanları inceleyin.

Örnek protokolde, L1 larvalarını sıvı kültürde daf-2 genini hedef alan RNAi ile tedavi edeceğiz.

- Tedaviye başlamak için, 2.800 mililitrelik bir Fernbach kültür şişesine ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ek reaktiflerle birlikte 207.45 mililitre S bazal ortamı ekleyin. Mililitre karbenisilin başına 50 mikrogram ve 1 milimolar IPTG nihai konsantrasyonu ekleyin ve şişeyi bir membran vidalı kapakla kapatın.

L1'leri 25 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve 15 mililitrelik tüplere aktarın. L1'leri üç dakika boyunca 1.900 kez g'de santrifüjleyin. Döndürdükten sonra süpernatanı çıkarın. Mikroskop altında, iki mikrolitre başına L1'leri sayın ve en az dokuz damladan elde edilen sayıların ortalamasını alın.

Daha sonra, genç solucan koleksiyonu için 50.000 solucan ve yaşlı solucan koleksiyonu için 100.000 solucanı önceki adımda hazırlanan dört Fernbach kültür şişesine ekleyin. Daha sonra, solucan sayısıyla orantılı olarak ilgilenilen gen için kontrol RNAi bakterileri ve RNAi bakterileri ekleyin.

Bakteri ekledikten sonra, toplam hacmi 300 mililitreye getirmek için S bazal ile solucan kültürünü tamamlayın. Solucan kültürünü, toplanana kadar 150 RPM ile çalkalanan bir inkübatörde 25 santigrat derecede inkübe edin.