Name: Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, tek adımlı metabolomik yöntemiyle GC/MS kullanarak biyolojik örneklerde karbonhidratlar, organik asitler ve amino asitleri analiz etmeyi. Bu yöntem, yenidoğan taramasında %38 ek genetik bozukluğu tespit ederek tanısal yeteneği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anthony Thomas bir teknik yardım minnetle kabul edilmektedir.

İdrar Örnekleri İşlem Prosedürü <ol><li> 37 ° C su banyosu içinde idrar örneği Çözülme. Orijinal tehlikeye yeni bir kap içine süzün. </li><li> Maksimum 13 ml örnek bir kısım etiketli konik santrifüj tüpüne alın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Ölçü ve birkaç damla idrar refraktometre koyarak örnek optik yoğunluk kayıt. </li><li> Filtre 0.2 um filtresi aracılığıyla örnek. </li><li> Optik yoğunluğuna göre aşağıda örnek hacmi ölçün <table border="0"><tbody><tr><td> 1.000-1.009 </td><td> 1.00 ml </td></tr><tr><td> 1.010-1.019 </td><td> 0.50 ml </td></tr><tr><td> 1.020-1.050 </td><td> 0.25 ml + 0.25 ml H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> 10 nmoles d 3 metilmalonik asit; her biri 100 nmoles aşağıdaki 13 C 3 laktat, 13 C 3 piruvat, 13 C 2 15 500 nanomol (nmoles) 3 Kreatin: Belirtilen birimi aşağıdaki iç standartları içeren bir Reactivial aktarılır N glisin, d 3 serin, d 5 fenilalanin, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d 4 sebacic asit, 13 C 6 glikoz, d 6 inositol ve d 5 triptofan. </li><li> 7.5 Birimler / üreaz ul çözüm (Calzyme Laboratuvarları katalog no. 116A0100) 20 mikrolitre (ul) sonra kızardı ve inert bir septum ile CO 2 altında mühürlü örnek eklenir. </li><li> Örnek 37 daha fazla karbon dioksit gazı ile 30 dakika basınç korumak için, en az 15 dakikalık aralıklarla eklendi ° C yapılır. </li><li> Üreaz çözeltisi ul 20 daha fazla karbon dioksit flakon ile temizlendi eklendi ve örnek bir 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tutulur. </li><li> 500 ul 30:70 aseton, metanol eklenir Kauçuk septum, Teflon kaplı septum ile değiştirilir ve örnek 15 dakika boyunca -20 ° C&#39;de soğutulmuş. </li><li> Katılar sonra temiz bir 2.0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) içine dekante x 1500 devirde 10 dakika santrifüj tarafından kaldırıldı. </li><li> Triethylammonium trifluoroacetate (TİM / TFA) (Sigma) aşağıdaki gibi ekleyin: <ul><li> 1.00 mL örnekleri için 20 ul </li><li> 0.5 ml veya daha az, numuneler için 40 ul </li></ul></li><li> Asetonitril ve yeri ile bir azot akışı altında 70 ° C sabit hacim elde edilinceye kadar (ÇAY / TFA kalacaktır) (~ 15 dakika). </li><li> Çökelti formları kadar (~ 10 dakika her), 4 kata kadar adım 13 tekrarlayın. </li><li> Yaklaşık 2 dakika soğumasını bekleyin. (4:00 dakika) üzerinde kaynatın dikkatli ve kuru olması, metilen klorür ile kapalı üst. </li><li> 15. adımı yineleyin. </li><li> Aşağıdaki oranlarda MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Bilimsel Termal) ekleyin: <ul><li> 1.00 mL örnekleri için 150 ul </li><li> 200 ml, 0.50 veya daha az, örnekler ul </li></ul></li><li> Cap, azot atmosferi ve inkübe altında 70 ° C 1 saat. </li><li> Gaz kromatograf / kütle spektrometresi ile analiz için, bir azot atmosferi altında microvials transfer. </li><li> Agilent 5975 GC / MS ile otomatik enjeksiyon yeri microvials: Cihaz sıcaklıkları: enjektör 200 ° C, arabirim 250 ° C fırında 80 ° C 1 dakika boyunca, rampa, 4 ° C / dakika 80-130 ° C, rampa 6 ° C / dakika 130-200 ° C, rampa, 12 ° C / dakika 200-285 ° C, 10 dakika tutun. Sütun: 25 m, 320 mikron kimliği, 0.5 mikron film kalınlığı DB-5. Kütle Özellikleri: kaynak 230 ° C, quad 150 ° C, 2.46 tarama / sn Tarama 50-650 amu. Solvent gecikme 3,5 dakika. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">buraya tıklayın</a> temsilcisi sonuçları görmek için.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

Metabolik Tarama Laboratuarı, Saint Louis Üniversitesi, kar amacı gütmeyen bir şirket tarafından sahip olunan bir CLIA lisanslı klinik laboratuvar. Dr Shoemaker laboratuar gelirlerinin doğrudan kâr değil, ancak laboratuar verimlilik dolaylı olarak yarar sağlayabilir. Yöntemler, teknikler, sonuçlar, normal sınırlarda, makro, yazılım, kütüphaneler veya sonuçların hiçbiri özel olarak kabul edilir ve ilgili tarafların serbestçe kullanılabilir.

Üreaz yöntemi (1) çeşitli değişiklikler ile tıp literatüründe 62 kez atıf yapıldı. Matsumoto grubu (2,3), yenidoğan tarama için yüksek verimli işlemi basitleştirilmiş ve 16000 hastalarda elde edilen sonuçlar bildirdi. Kuhara ve diğerleri (4-7), birkaç olguda doğuştan hata tanı yöntemi kullanımı rapor ve takip var. Motörhead (8) ayrıca klinik tanısı için yöntemin faydaları doğruladı ve takip doğuştan. Bu yöntem tüm meyve sinekleri ve onların larvaları (9), fare, filler ve homojenatlarında knock-out, ayıların idrar tatbik edilmiştir. Site directed mutagenesis önce ve sonra Cryptococcus Kültür (10) üreaz adım olmadan medya da analiz edildi. Bu yöntem, triptofan, metionin ve izolösin amino asitlerin (11) oral dozlarda konular yükledikten sonra Down sendromlu hastalarda ve Demanslı yaşlı gazileri, tıp öğrencileri insan beslenme değerlendirmesi için uygulanan olmuştur. Tüm sekiz B vitaminleri, aralarında kendi bozulması bazı noktada 8 vitaminli gerektiren üç amino asit yıkım ürünleri niceleme değerlendirildi. Vitamini takviyesi, ilaç ve onların azaltma toksik etkileri (12) bildirilmiştir. Normal ve Down sendromu gebelik amniyon sıvısı örnekleri analiz ve rapor edilmiştir (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Bilgisayar</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Bilgisayar</td></tr><tr><td>Üreaz</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Ayrıca Sigma C3</td></tr><tr><td>Stabil İzotop Standartları</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çözücüler</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Kolonları</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Flakonlar</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

bir adım metabolomik: karbonhidratlar, tek bir usul sayısallaştırılmış organik ve amino asitler

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

ABD&#39;de doğan her çocuk artık &quot;doğuştan metabolizma&quot; olarak adlandırılan 42 nadir genetik bozukluklar kadar gösterildi. Tarama yöntemi, tandem kütle spektrometresi ve organik acidemias için bir ekran olarak acylcarnitines rakamlarla ve aynı zamanda amino asitler ölçer. Bütün devletler, galaktozemi gibi karbonhidrat bozuklukları için enzimatik test uygulayın. Olumlu sonuçlar non-spesifik takip test sonuçları olabileceğinden daha kesin bir yöntem kullanılarak gerekli. Bu rapor, doğuştan gelen bir hata tarama için numune hazırlama &quot;üreaz&quot; yöntemi açıklanmıştır. Kristal üreaz enzim üre, en diğer suda eriyen metabolitleri, tek bir işlem olarak gaz kromatografisi için kurutulmuş ve derivatized izin vücut sıvıları kaldırmak için kullanılır. Buharlaşma yoluyla azot akışı Dehidrasyon asetonitril ve metilen klorür ekleyerek kolaylaştırılır. Sonra, trimethylsilylation eşsiz bir katalizör, triethylammonium trifluoroacetate varlığı yer alır. Otomatik enjeksiyon ve kromatografi 192 metabolitleri ve TMS derivatized biyolojik bileşiklerin kütle spektrumları özel kütüphaneleri kullanılarak her büyük bileşeni yarı kantifikasyon makro odaklı özel kantifikasyon tarafından takip edilmektedir. Yazarın mevcut makro ve kütüphaneleri kullanarak yaygın olarak kullanılan ChemStation platformu analizi yapılabilir. , Numunelerin sonuçlarının% 17 sipariş hekim tarafından ona göre hareket edilmelidir bulgular ortaya olduğunu Laboratuvarımızda, yaklaşık% 17 bir tanısal yöntem kullanılarak 16.000 &#39;den fazla hasta numunelerinin analiz edilmiştir. Yaklaşık% 38 önceki yöntemler kullanılarak tanı bulunmamış olan 180 teyit doğuştan hataları üzerinden bu dahildir.

Üreaz yöntemi aracı metabolitlerin GC / MS analizi için numune hazırlama, mucit tarafından sunulmaktadır. Bu yöntem, bir adım, tek bir süreç niceleme karbonhidratlar, organik ve amino asitler tandem kütle spektrometresi ile doğumsal yenidoğan tarama takip.

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

ABD'de doğan her bebek, günümüzde "doğuştan metabolizma hastalıkları" olarak adlandırılan 42'ye kadar nadir genetik bozukluk için taranmaktadır. Tarama yöntemi ... üzerine kuruludur.

Bu tek aşamalı metabolomik prosedürde, biyolojik örnekler karbonhidratların, organik ve amino asitlerin gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile analizi için tek bir işlemle hazırlanır. Örnekler önce üreyi uzaklaştırmak için üreaz enzimi ile işleme tabi tutulur. Prosedürün ikinci adımı, örneklerin iki uçucu bileşenden oluşan bir deterjan, triathlon, amonyum ve tri fluoro acetate varlığında dehidre edilmesidir.Bunu, bileşenlerin trimetilasyon yoluyla türevlendirilmesi takip eder. Ve son olarak, gaz kromatografisi, kütle spektrometrisi ağacı ile karbonhidratların, organik ve amino asitlerin, izol, glisin ve amino şekerlerin otomatik kantifikasyonu; neonatal taramalarda bulunan çoğu genetik bozukluğun ve şu anda tandem kütle spektrometrisi ile taranmayan bozuklukların ek olarak %38'inin onaylanmasına ve takibine olanak tanır. Merhaba, ben St. Louis Üniversitesi Metabolik Tarama Laboratuvarı'ndan Jim Shoemaker.Asitleri, bazları ve nötr bileşikleri ayırmadan biyolojik sıvıların ara metabolitler açısından analiz edilmesini sağlayan bir yöntem olan tek basamaklı metabolomikleri göstermek için buradayım. Bu yöntem, organik asitlerin, amino asitlerin, karbonhidratların, karbonhidrat türevlerinin ve ACell glisinin hepsini tek bir adımda analiz etmenize olanak tanıyan tek bir prosedürle, tandem kütle spektrometresi ile yapılan yenidoğan taramasının takibini yapmayı mümkün kılar. Bunun sonucu olarak, arkamdaki grafikte kırmızı ile belirtilen tanıların tek basamaklı metabolomikler kullanılarak konulabildiği, ancak mevcut tandem kütle spektrometresi yenidoğan taramasıyla tespit edilemeyeceği görülmektedir.Öyleyse demonstrasyona başlayalım. Bu prosedüre başlamak için idrar örneğini 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin. Eğer orijinal kap zarar görmüşse, bir örneği yeni bir kaba aktarın.Örnekten bir alikot alın ve bunu yedek olarak etiketli konik bir santrifüj tüpünde -20 °C'de saklayın. Ardından, el tipi refraktometreye birkaç damla idrar damlatarak örneğin optik yoğunluğunu ölçün ve kaydedin. Optik yoğunluğu ölçtükten sonra, örneği 0.2 µm'lik bir filtreden süzün.Filtrasyon öncesinde ölçülen optik densiteye göre numune hacmini belirleyin. 1 ile 1,009 arasındaki değerler için bir mililitre numune, 1,01 ile 1,019 arasındaki değerler için 0,5 mililitre numune kullanın ve 1,02 ile 1,05 arasındaki değerler için 0,25 mililitre numuneyi 0,25 mililitre su ile birleştirin.Belirtilen hacmi, burada gösterilen tabloda belirtilen izotop işaretli internal standartları zaten içeren reaktif bir viale aktarın. Standartlar arasında kreatin, metilmalonik asit, laktat, pirüvat, glisin, sine fenilalanin, heksa oil, glisin, orat, SEBA asidi, glukoz, inositol ve triptofan yer almaktadır. Ardından, mikroliter başına 7.5 ünite konsantrasyonunda 20 µL üreaz çözeltisi ekleyin.Numuneyi inert bir septum aracılığıyla karbondioksit ile yıkayın ve mühürleyin. Basıncı korumak için her 15 dakikada bir daha fazla karbondioksit gazı ekleyerek numuneyi 37 °C'de 30 dakika bekletin; 30 dakikalık inkübasyonun sonunda 20 µL daha üreaz çözeltisi ekleyin. Viyali karbondioksit ile yıkayın ve numuneyi 15 dakika daha 37 °C'de tutun.Üreaz işlemi tamamlandığında, üreaz işleminin hemen ardından numuneyi doğrudan dehidrate etme ve türevlendirme aşamalarına geçiniz. Numunelere 30 ila 70 oranında aseton ve metanol çözeltisinden 500 microliters ekleyiniz. Kauçuk septumu Teflon kaplı bir septumla değiştiriniz.Numuneyi -20 °C'de 15 dakika boyunca soğutun. Katı maddeleri 1500 RPM'de 10 dakika santrifüj ederek uzaklaştırın ve ardından süpernatantı temiz bir 2,0 CC reaktif şişeye aktarın. Şimdi, trimetilleme katalizörü olan tri amonyum trifloroasetat (TFA) ekleyin; 1 mL'lik numuneler için 20 µL, 0,5 mL veya daha küçük numuneler için ise 40 µL ekleyin.Asetonitril ile tamamlayın ve hacim sabitlenene kadar 70 °C'de azot akışı altına yerleştirin; bu durum yalnızca T-E-A-T-F-A'nın kaldığını gösterir. Bu işlem yaklaşık 15 dakika sürer. Asetonitril ile tekrar tamamlayın ve çökelek oluşana kadar, hacim sabitlenene kadar 70 °C'de azot akışı altında tutma işlemini dört kez tekrarlayın.Dehidratasyondan sonra her seferinde bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer, yaklaşık iki dakika soğumaya bırakın. Kaynamayı önlemeye dikkat ederek metilen klorür ile tamamlayın ve kurutun. Bu işlem yaklaşık dört dakika sürer.Metilen klorür ile tamamlayın ve kurutun. Bir kez daha tekrarlayın. Ardından, numuneyi türevlendirin.Bir mililitrelik örnekler için 150 µL OFM, STFA ve 0,5 mL veya daha az olan örnekler için 200 µL ekleyin. Örnekleri nitrojen atmosferi altında kapatın ve 70 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik inkübasyonun sonunda, örnekleri bir gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile analiz etmek üzere mikro viallere aktarmak için nitrojen atmosferi altında çalışın; burada DB five kapiler kolonlu Agilent 5975 GCMS kullanılmıştır.Kütle spektrometresi için kaynağı 230 °C'ye, quad'ı 150 °C'ye ve tarama kütle aralığını saniyede 2,46 tarama hızında 50 ile 650 AMU arasına ayarlayın. Solvent geciktirme süresi 3,5 dakikadır. Cihaz sıcaklıkları enjektör için 200 °C ve 250 °C'dir.Arayüz için, fırını bir dakika boyunca 80 °C'ye ayarlayın, ardından 80 °C'den 130 °C'ye dakika başına dört °C artışla ısıtın; sonrasında 130 °C ile 200 °C arasında dakika başına altı °C artışla ısıtın ve son olarak 200 °C'den 285 °C'ye dakika başına 12 °C artışla ısıtıp 10 dakika boyunca bekletin. GCMS tarafından otomatik enjeksiyon için deriv eye örneklerini içeren mikro vialleri yerleştirin ve analizi başlatın. Üreaz işleminden sonra GCMS ile analiz edilen bir idrar örneğinin temsili spektrumu burada gösterilmiştir; pikler pyro glutamic acid, four hydroxy cyclo acetic acid ve hawkinson metabolitlerine karşılık gelecek şekilde işaretlenmiştir.Bu metabolitler, nadir bir genetik bozukluk olan Hawkins Anürisinin göstergesidir. Spektrumdaki tüm pikler bilinen metabolitlere atanabilir ve miktarları belirlenebilir. İlk yenidoğan tarama testlerinin sonuçları spesifik olmayabilir.Buna karşın, burada gösterildiği gibi GCMS ile analiz edilen idrar örneğindeki yüksek Hawkins UR metabolit seviyeleri, bu doğumsal metabolizma hastalığının teşhisini doğrulamıştır. Aynı URIs yöntemi kullanılarak 184 hastada doğumsal hatalar teşhis edilmiştir. Kırmızıyla gösterilen tanıların yaklaşık %40'ı, yenidoğan taramasında yaygın olarak kullanılan tandem kütle spektrometrisi ile konulamazdı.Böylece, biyolojik sıvıları karbonhidratlar, organik ve amino asitler ile açil glisin açısından tek bir prosedürde analiz etmek için üreaz yöntemini kullanarak tek aşamalı metabolomik işleminin nasıl yapılacağına dair gösterimimiz tamamlanmış oldu. Prosedürün etkinliğini değerlendirirken; üreaz sindirimi, dehidrasyon ve trimetilsililasyon aşamalarının tam olarak gerçekleşip gerçekleşmediğinin, yalnızca tüm iç standartların varlığı kontrol edilerek değerlendirilebileceğini hatırlamak önemlidir.İç standartlar, örneğinleyle, eğer gerçekleşmeseydi kreatinin TRI TMS'nin tam miktarda bulunmayacağı gerekçesiyle,dehidrasyonun tamamlandığını kanıtlamak için kasıtlı olarak seçilmiştir. Dolayısıyla kanıtımız budur. Chem station kullanarak bu prosedürü yorumlamak için geliştirdiğimiz makrolar ve kütüphanelerle ilgileniyorsanız, lütfen ekranınızda görünen adresten bana e-posta gönderin; laboratuvarımız hakkında daha fazla bilgiye ekranınızdaki URL'den ulaşabilirsiniz.Çok teşekkürler. Ben Jim Shoemaker.

one-step-metabolomics-carbohydrates-organic-amino-acids-quantified

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Bu makalenin amacı, metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması için bir protokol açıklamak için, özellikle, kapiller Elektroforez-kütle spektrometresi.

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

XY-Meta ve metaX'i birbirine entegre eden hedefsiz bir metabolomik iş akışı oluşturduk. Bu protokolde, açık erişim spektrumu referansından bir aldatmaca spektral kütüphanesi oluşturmak için XY-Meta'nın nasıl kullanılacağını gösterdik ve daha sonra FDR kontrolünü gerçekleştirdik ve metabolomik spektrumları tanımladıktan sonra metabolitleri ölçmek için metaX'i kullandık.

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Öğrenin, tek adımlı metabolomik yöntemiyle GC/MS kullanarak biyolojik örneklerde karbonhidratlar, organik asitler ve amino asitleri analiz etmeyi. Bu yöntem, yenidoğan taramasında %38 ek genetik bozukluğu tespit ederek tanısal yeteneği artırır.

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

Daha fazla video keşfet