Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna E3 ortamında 5 embriyo ekleyerek başlayın ve fazla ortamı bir pipetle çıkarın. Kontaminasyonu önlemek için her bir oyuğa kanamisin içeren E3 ortamı ekleyin. Embriyoların 28 santigrat derecede büyümesine izin verin.

Birkaç konsantrasyon veya doz hazırlamak için ilgilenilen bileşiği DMSO gibi uygun bir çözücü ile seyreltin ve her dozun gelişmekte olan embriyolar üzerindeki etkisini test edin. Embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, her bir stok çözeltisini ayrı ayrı oyuklara pipetleyin. Plakayı bir kapakla örtün ve içindekileri karıştırmak için hafifçe döndürün. Kuyu plakasındaki embriyoların 28 santigrat derecede büyümesine izin verin.

Embriyonik gelişimde istenen zamanda, embriyoların fenotipini incelemek için kuyu plakasını uygun bir mikroskop altına yerleştirin. Gelişmekte olan embriyolarda göz kaybı, gecikmiş büyüme veya melanosit kaybı gibi fenotipleri gözlemleyebilirsiniz. Aşağıdaki protokolde, ön beyin gelişiminin küçük moleküllü inhibitörleri için bir bileşik kütüphanesini test edeceğiz.

- Küçük molekül kütüphaneleri tipik olarak 96 oyuklu bir kaynak plakasında sağlanır ve her bileşik DMSO'da 10 milimolar bir stok olarak depolanır. Embriyolar istenen aşamaya ulaşmadan yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküllerin alikotlarını içeren uygun sayıda 96 oyuklu plakayı çözün. Kaynak plakalarının seri veya diğer kimlik numaralarını not edin. Plakalardaki yoğuşmayı en aza indirmek için, kurutucu içeren bir kurutma odasında çözdürün.

Plakaları, çok kuyulu bir plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüjde kısaca döndürün. Alüminyum sızdırmazlık bandını kaynak plakasından çıkarın. 12 kanallı bir pipet kullanarak, kaynak plakasındaki bileşikleri DMSO ile istenen konsantrasyona seyreltin. Bu protokolde, 0.5 milimolar stok plakasını seyreltmek için 0.5 milimolar nihai konsantrasyon kullanıyoruz ve 4.75 mikrolitre DMSO ekliyoruz.

96 oyuklu plakadaki embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, kaynak plakalardan 2,5 mikrolitre bileşiği embriyoları içeren alıcı plakalara aktarmak için 12 kanallı bir pipet kullanın. Şimdi embriyoları ve bileşikleri içeren plakaları kapaklarla kapatın ve embriyo plakalarının üzerine kaynak plakaların kimlik numarasını kaydedin. Plakaları hafifçe döndürerek karıştırın ve 28,5 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Kullanılmayan küçük moleküller içeren her bir kaynak plakasını alüminyum sızdırmazlık bandı ile kapatın ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun.

Görsel ekranı gerçekleştirmeden önce, belirli bir isabet kriteri formüle edin. Örneğin, ön beyin gelişiminin küçük moleküllü inhibitörleri için bir ekranda, bir isabet, ön beynin kaybını sağlayan bir bileşik olabilir. Gözlerin yokluğu, ön beyin kaybının kolay bir görsel göstergesidir ve test için floresan gerektirmez.

Gelişimde istenen zamanlarda, bileşik muamele edilmiş embriyoları içeren 96 oyuklu plakaları inkübatörden çıkarın ve her bir kuyucuğu bir stereo mikroskop altında inceleyin. Ön beyin gelişiminin küçük moleküllü inhibitörlerini tararken, ön beyin gelişimsel inhibisyonunun bir belirteci olarak göz kaybı için 28 saat sonra plakaları inceleyin. 5 embriyodan en az 3'ünün öngörülen isabet fenotipini sergilediği herhangi bir kuyu için plakanın kimliğini ve kuyu konumunu kaydedin.

96 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin. 48 saat sonra göz ve ön beyin kaybını tekrar onaylayın. Embriyoların ön beyni olmasa da, en az dört gün hayatta kalacaklar. Bileşiğin etkilerini birkaç dozda tekrar test ederek potansiyel bir isabeti yeniden onaylayın. Her doz için, 10 embriyo 0.5 mililitre E3 ortamında 48 oyuklu bir plaka formatında test edilir.

Yeniden test için bileşik eklemenin zamanlaması, orijinal taramanınkiyle aynı olmalıdır. Ortaya çıkan fenotip, bileşiğin yeniden test edilmesine bağlı bir şekilde doza bağlı bir şekilde yeniden üretildiğinde bir isabet doğrulanır. Son olarak, kimyasal kütüphanedeki küçük moleküllerin veri tabanından isabet eden bileşiği tanımlayın.