JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 3:39 dk. • April 30th, 2023
- Metronidazol'ü bir çözücü olan DMSO içeren yumurta suyunda çözün ve embriyolarda pigment oluşumunu önleyen feniltiüre ekleyin. Uygun yaştaki birkaç larvayı tedavi ve kontrol plaklarına aktarın. Daha sonra, istenen metronidazol çözeltisi konsantrasyonunu test plakasına ve DMSO içeren yumurta suyunu kontrol plakasına ekleyin.
Her iki plakadaki larvaların 28 santigrat derecede büyümesine izin verin. Transgenik larvalar sadece hepatositlerde nitroredüktaz üretir, bu da metronidazolü sitotoksik bir ilaca dönüştürür ve sadece hedeflenen hepatositlerin ölümüne neden olur. Tedaviden sonra, metronidazol çözeltisini tedavi plakasından çıkarın ve embriyoları yumurta suyu ile yıkayın.
Larvaları uyuşturmak için trikamid ekleyin ve şiddetli hepatosit ablasyonu (karaciğer hücrelerinin yok edilmesi) için epifloresan mikroskobu altında inceleyin. Tedavi edilen bireylerde, kontrol grubundaki bireylere göre çok daha küçük bir karaciğer gözlemleyeceksiniz. Örnek protokolde, karaciğer rejenerasyonunu incelemek için transgenik zebra balığı larvalarında hepatosit ablasyonu için metronidazol kullanacağız.
- 100'e kadar embriyoyu 25 mililitre yumurta suyu içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kabı 28 santigrat dereceye yerleştirin. Pigmentasyonu engellemek için, döllenmeden 10 saat sonrasına kadar kültüre PTU ekleyin. Döllenmeden 80 saat sonra, larvaları trikat ile uyuşturun ve CFP pozitif larvaları toplamak için bir epifloresan mikroskobu kullanın, sadece benzer büyüklükte karaciğerleri olan hayvanları tutun
Daha sonra tricaine yumurta suyunu PTU ile desteklenmiş taze yumurta suyu ile değiştirin ve CFP pozitif zebra balığı larvalarını 28 santigrat derece kuluçka makinesine geri koyun. Zebra balığı larvalarını MTZ ile tedavi etmek için önce uygun sayıda larvayı iki farklı kültür kabına bölün. Deney larva grubunu taze hazırlanmış MTZ çözeltisinde ve kontrol grubunu DMSO ile takviye edilmiş yumurta suyunda tutun.
MTZ'nin foto inaktivasyonunu önlemek için deney grubunu alüminyum folyo ile örtün ve her iki zebra balığı larva grubunu 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ablasyon süresinin sonunda, MTZ solüsyonunu plakalardan çıkarın ve MTZ ile muamele edilmiş lavları 25 mililitre yumurta suyu ile iki ila üç kez yıkayın ve her yıkamadan sonra yumurta suyunu atın. Son yıkamadan sonra, MTZ ile tedavi edilen larvalarda kalp ödemi ve ölümü önlemek için daha önce kullanılan trikain konsantrasyonunun yarısı ile larvaları hareketsiz hale getirin. Daha sonra, MTZ ile muamele edilen lavların nispi karaciğer boyutuna bağlı olarak hepatosit ablasyon seviyelerini değerlendirmek için bir epifloresan mikroskobunda CFP filtresini kullanın. Larvaların %0 ila %5'ini temsil eden büyük karaciğerli zebra balıklarının nonablasyon, larvaların %10 ila %20'sini temsil eden orta büyüklükte karaciğere sahip olanların kısmen ablasyon ve larvaların %80 ila %90'ını temsil eden çok küçük karaciğere sahip olanların tamamen ablasyon yapılacağını düşünün.