Morfolino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Bir Yöntem

- Bir genin işlevini belirlemeye yönelik bir yaklaşım, ifadesini yıkmak ve etkisini gözlemlemektir. Morpholino oligomerleri genellikle zebra balıklarında nakavt çalışmalarında kullanılır. Bir morfolino, hedef gen ekspresyonunu inhibe eden, yaklaşık 25 baz uzunluğunda sentetik DNA benzeri bir moleküldür.

Morfolino tedavisi için, kısmen kesilmiş bir kuyruk yüzgeci olan anestezi uygulanmış bir balığı bir enjeksiyon plakasına yerleştirin ve plakayı stereo mikroskop altına yerleştirin. Enjekte edilmemiş ventral taraf kontrol görevi görürken sadece sırt tarafını enjekte edin. Morpholinos, hedefledikleri diziye bağlı olarak iki şekilde işlev görebilir. İlk olarak, bir mRNA üzerindeki translasyon başlangıç bölgesine birleşirler ve translasyonu bloke ederek protein sentezini önlerler.

İkincisi, bir pre-mRNA üzerindeki intron-ekzon bağlantısına bağlanabilir ve uygun uçbirleştirmeyi önleyebilir, bu da hücre tarafından bozulacak kusurlu bir transkript ile sonuçlanır. Daha sonra, kuyruk yüzgeçlerini büyüme açısından inceleyin. Morfolino ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen bölgelerin yeniden büyümesi arasındaki farklar, hedeflenen proteinin yüzgeç rejenerasyonunda rol oynadığını göstermektedir. Bu protokolde, kaudal yüzgeç rejenerasyon testinin bir parçası olarak morfolinoları kullanacağız.

- Morfolino enjeksiyonundan bir gün önce, kuyunun bir ucunda bir çentik kesilmiş% 2 agarozlu bir enjeksiyon plakası yapın, bu da balığın enjeksiyon prosedürü için stabilize edilmesine yardımcı olacaktır. Enjekte etmeden hemen önce, florosein etiketli morfolinoyu RNAaz ve DNAaz içermeyen suda uygun konsantrasyona seyreltin ve beş dakika boyunca 65 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Önceden hazırlanmış bir enjeksiyon iğnesi yükleyin ve ucu belirli bir açıyla kesin.

Daha sonra, balığı uyuşturun ve enjeksiyon plakasına yerleştirin. Tüm fazla sıvıyı çıkarın ve plakayı bir stereo mikroskop tablasına yerleştirin. İğneyi kemik ışınının hemen distaline yönlendirin.

İğneyi nazikçe her kemik ışınının hemen distalindeki rejeneratif dokuya sokun ve blastema içine yerleşene kadar distal olarak itin. İğne doğru bir şekilde lokalize edildiğinde, mikroenjeksiyon sistemi talimatlarını takip edin ve enjeksiyon başına beş nanolitrelik bir morfolino damlası enjekte edin. Her enjeksiyonda, enjeksiyonun blastema lokalizasyonuna yardımcı olan sarı bir morfolino çözeltisi görülebilir. Orta hattan dorsal olarak çalışarak, dorsal taraftaki kemik ışını başına yaklaşık 75 nanolitre morfolino enjekte edin ve ventral tarafı sadece elektroporasyon kontrolü olarak bırakın.