İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

- İlgilenilen embriyoları, döllenmeden 24 saat sonra başlayan pigment oluşumunu engellemek için fenil tiyoüre, PTU, Ringer çözeltisine yerleştirin. Bu, bu prosedür için gerekli olan gelişmekte olan anatomiyi daha görünür hale getirir. Triklike anestezi uygulanmış bir embriyoyu bir görüntüleme odasına aktarın. Üstüne bir cam slayt yerleştirin ve mikroskobunuzun altında görüntüleyin. Transgenetik olarak GFP'yi ifade ettiği için 488 nanometre lazer altında görülebilen yaralanacak aksona odaklanın.

Sitenin önceki görüntüsünü alın. Ardından, GFP'nin kırmızı floresan vermesine neden olan 910 nanometre lazerle aksonu görüntüleyin. Çevredeki dokuyu etkilemeden hedef bölgeyi yaralamak için bu lazerin yoğunluğunu artırın. Bu işleme aksotomi denir. Dağınık döküntü olarak görünen aksotomiyi doğrulamak için ilk lazerle yeni bir görüntü çekin. Aşağıdaki protokolde, iki fotonlu bir lazer kullanarak zebra balığı embriyolarında periferik duyusal aksonların aksotomisini gerçekleştireceğiz.

- Laboratuvarınızda özel yapım iki fotonlu bir skop yoksa, Zeiss 510 konfokal iki fotonlu mikroskop aksonları ayırmak için de kullanılabilir. Monte edilmiş embriyoyu sahneye yerleştirerek ve 25x su hedefi kullanarak odak haline getirerek başlıyoruz. Ardından, iki foton ve argon lazerini çok kanallı bir ayarda açın, böylece birinden diğerine geçmek mümkün olur.

Her iki lazer de GFP'yi tespit etmek için kullanılsa da, ikisini ayırt etmek için iki foton emisyonu kırmızı ile ve argon lazer emisyonu yeşil ile görselleştirilir. Yaralanacak bir aksonu tanımlamak için argon lazerini kullanın. Z ayarları altında, ilk ve son optik bölümleri işaretleyin, eş odaklı bir görüntü alın ve Z yığınının maksimum projeksiyonunu oluşturun.

Argon lazerini kapatın ve iki foton lazerini açın. Aksonun hala odakta olduğundan emin olmak için yaklaşık% 9'luk bir iletim yoğunluğunda tarayın. Kırpma aracının kullanılabilir olması için Durdur düğmesine tıklayın. İlgilendiğiniz alanı yakınlaştırmak için Kırp'ı kullanın. Genellikle yaklaşık 70x'e yakınlaştırırız. Aksonun yaralanacak bölgesini seçin ve bu bölgeyi odak noktasına getirin. Yakınlaştırma, Mod sekmesi altında kontrol edilebilir.

Ardından, Kanallar sekmesi altında, iki fotonun yoğunluğunu yaklaşık %9 iletimden %15 ila %30 iletime değiştirin. Yeni ayarları etkinleştirmek için Hızlı XY düğmesine tıklayın ve ardından aşırı hasarı önlemek için hızlı bir şekilde Durdur'a tıklayın. Prosedür işe yaradıysa akson dağınık döküntü olarak görülmelidir. Son olarak, aksonun gerçekten hasar gördüğünden emin olmak için 488 nanometre argon lazere geri dönün. Başka bir eş odaklı görüntü çekin ve Z yığınlarının maksimum projeksiyonunu oluşturun.