Embriyo Mikroenjeksiyonu: Zebra Balığı Sarısı İçine Bir Bileşik Verme Tekniği

- Enjeksiyondan bir gece önce iki dişi ve iki erkek balığı bölünmüş bir üreme tankına koyun. Ertesi sabah, bölücüyü çıkarın ve tankın dibinde yumurtaları görene kadar balıkların üremesine izin verin. Yumurtaları toplayın ve bir mantar ilacı olan metilen mavisi içeren E3 ortamı ile yıkayın. Yumurtaları mikroskop altında gözlemleyin ve döllenmemiş yumurtaları çıkarın. Döllenmemiş yumurtalar berrak bir yumurta sarısı zarına sahipken, döllenmiş yumurtalar koyu renkli bir yumurta sarısı zarına sahiptir.

10 embriyoyu enjekte edilmemiş kontroller olarak ayrı bir Petri kabında tutun. Bir transfer pipeti kullanarak, embriyoları oda sıcaklığında bir mikroenjeksiyon plakasının oluğuna hizalayın ve mikroskobun altına yerleştirin. Mikroenjeksiyon iğnesini nazikçe koryondan yumurta sarısına itin ve fenol kırmızısı gibi bir işaretleyici içeren ilgili bir bileşiği yavaşça enjekte edin. Sitoplazmik akış, bileşiğin embriyonik hücrelere yayılmasını sağlar.

Enjeksiyondan sonra, embriyoları 28 santigrat derecede metilen mavisi ile E3 ortamında büyütün. Embriyoların sağlığını kontrol etmeye devam edin. Ölü veya anormal gelişen embriyoları çıkarın ve ortamı günlük olarak değiştirin. Aşağıdaki protokolde, zebra balığı embriyolarına bir ribonükleoprotein veya RNP kompleksi vermek için mikroenjeksiyon kullanacağız.

- İlk olarak, zebra balığı deneklerini metin protokolünde açıklandığı gibi enjeksiyonları gerçekleştirmeden önceki gece üreme için hazırlayın. Daha sonra Cas9 proteini ve sgRNA'yı ikiye bir oranında birleştirin. Cas9 ve sgRNA bir ribonükleoprotein kompleksi oluştururken, çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, beş mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için yeterli RNaz içermeyen suya 0.5 mikrolitre% 2.5 fenol kırmızısı çözelti ekleyin.

Enjeksiyon iğnesini hazırlamak için, bir milimetrelik bir cam kılcal damarı çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın. Daha sonra açılı bir açıklık elde etmek için elde edilen cam iğnenin ucunu bir tıraş bıçağıyla kesin. İğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, iğne Petri kabına sürekli olarak bir nanolitre çözelti enjekte edene kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın.

- Embriyo mikroenjeksiyonu yapmadan önce, iğne hazırlama ve sadece boya içeren bir çözelti kullanarak kontrol embriyolarını enjekte etme alıştırması yapın ve gelişimden 24 saat sonra hayatta kalmayı kaydedin. Enjekte edilmemiş bir kontrole kıyasla% 90'dan fazla sağkalım elde edebilmelisiniz.

- Ardından, kontrol popülasyonu olarak 10 ila 15 embriyo seçin ve bunları ayrı bir etiketli Petri kabına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, kalan embriyoları oda sıcaklığında bir enjeksiyon plakasına dikkatlice hizalayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, çözeltinin bir nanolitresini her embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları etiketli bir Petri kabına geri koyun ve üzerlerini metilen mavisi içeren 1X E3 ortamı ile kaplayın. Enjekte edilen embriyoları 24 saat boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, ölü veya anormal şekilde gelişen bireyleri çıkarmak için enjekte edilen embriyoları inceleyin.