JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 4:47 dk. • April 30th, 2023
- Kardiyomiyopati, kalp kasının zayıfladığı ve kan pompalama yeteneğini kaybettiği bir durumdur. Bu durum zebra balıklarında tekrarlanabilir. İlk olarak, birkaç çalışma konsantrasyonu hazırlamak için Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde kardiyotoksisiteden sorumlu bir ilacın stok çözeltisini seyreltin. Daha sonra, tricaine anestezi uygulanmış bir balığı, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde, diseksiyon mikroskobu altında bir tutma süngeri üzerine yerleştirin. İğneyi yataydan 45 derecelik bir açıyla pelvik yüzgeçler arasına yerleştirin.
Şimdi iğneyi yavaşça 1 ila 2 milimetre periton boşluğuna itin ve ilaç çözeltisini yavaşça enjekte edin. Solüsyonun dışarı sızmasını önlemek için iğneyi çekmeden önce beş saniye bekleyin. Balıkları hemen taze sistem suyu içeren temiz bir tanka aktarın. Şiddetli kardiyotoksisite, kalp kası hasarı nedeniyle her gün ölen balık sayısını kaydedin. İlaç, kardiyomiyosit hücre zarında bulunan ölüm reseptörlerine bağlanır ve apoptozu tetikleyerek ciddi kardiyotoksisiteye neden olur.
Her ilaç konsantrasyonu için zaman içinde hayatta kalma olasılığını gösteren bir grafik olan bir hayatta kalma eğrisi oluşturun. Örnekte, yetişkin bir zebra balığında kardiyomiyopatiyi iki şekilde indüklemek için doksorubisin veya DOX enjekte edeceğiz.
Balığa DOX enjekte etmeden önce balığı 24 saat aç bırakın. Sonra, balıkları gruplandırın. Anestezi altındayken, her balığı kurutmak ve vücut ağırlığını ölçmek için temiz bir filtre kağıdı kullanın. Hepsi aynı vücut ağırlığının %10'u içinde olan balık grupları oluşturun, böylece her gruba aynı dozda DOX enjekte edilebilir. Daha sonra, her grup için DOX'un çalışma konsantrasyonunu hesaplayın, böylece her gruba beş mikrolitre çözelti enjekte edilir ve vücut ağırlığına göre aynı dozda DOX alır.
Ardından, DOX stoğunu 1x HBSS'de seyreltin. Seyreltmeyi bir girdapla karıştırın ve ardından tüpte bir araya toplanmasını sağlamak için seyreltmeyi darbeyle döndürün. Enjeksiyon için bir enjeksiyon platformu hazırlayın. Temiz bir 100 milimetre Petri kabına bir sünger yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla, bir balığı tutmak için süngerin içine bir boşluk açın, genellikle dört santimetre işe yarar.
Ardından, 34 gauge bir iğneye 10 mikrolitrelik bir mikroşırınga takın. Ardından, şırınga ve hortumdaki kabarcıkları veya blokları çıkarmak için iğneyi 1x HBSS ile durulayın. Şimdi, yetişkin balığı tricaine ile kısaca uyuşturun. Daha sonra, süngeri trikadlı embriyo suyuna batırın ve enjeksiyon için karnı yukarı bakacak şekilde bir balığı süngerin üzerine aktarın. Şimdi, iğneyi yaklaşık 1 ila 2 milimetre derinliğindeki pelvik yüzgeçler arasındaki orta hatta 45 derecelik bir açıyla hızlı bir şekilde sokarak intraperitoneal olarak DOX solüsyonunu enjekte edin.
Ardından, tüm DOX çözümünü yavaşça serbest bırakın. İğneyi geri çekmeden önce beş saniye bekleyin. Alternatif olarak, balıklar iç kısım sağa bakacak şekilde yanal olarak konumlandırılabilir. Daha sonra, pelvik yüzgecin üzerindeki yanal çizgiye, eğim yukarı bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla ve 3 ila 4 milimetre derinlikte saat 7'ye doğru enjekte edin. Enjeksiyon için her iki yöntem de başarılı olursa, göbekte kırmızı bir renk tonu olacaktır.
Enjeksiyondan sonra, balığı hızlı bir şekilde toparlanabileceği taze sistem suyuyla dolu temiz bir geçiş tankına aktarın. Ardından, iğneyi HBSS ile durulayın ve bir sonraki balığı enjekte etmeye devam edin. Daha sonra, çapraz kontaminasyonu önlemek için enjekte edilen balığı çalışan sirkülasyonu olan ancak ana sistemden ayrı bir sisteme geri koyun. Önümüzdeki 24 saat boyunca balıkları oruç tutmaya devam edin. İlk hafta boyunca, enjeksiyondan sonra, balığı günlük olarak kontrol ettiğinizden ve ölü balıkları çıkardığınızdan emin olun.