Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, fare beyin dokusunu immüno elektron mikroskobisi için hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle hayvanın perfüzyonu yoluyla beynin fikse edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise beynin kesilmesi ve kesitlerin immünohistokimya için işlenmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı kesitlerin osmiyumlanması,yevüresizleştirilmesi ve gömülmesidir. Prosedürün son adımı ise ultra ince kesitlerin alınmasıdır. Nihayetinde, merkezi sinir sisteminin farklı bölgeleri ve hücre tipleri içindeki çeşitli proteinlerin dağılımını yüksek uzamsal çözünürlükte gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'ndeki Esca Laboratuvarı'ndan Maria Trombley. Bugün size immün elektron mikroskobu için fare beyin dokusu hazırlama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda gelişim, deneyime bağlı plastisite ve yaşlanma sırasında mikroglia ve sinapslar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Fare beynini intrakardiyak perfüzyon yoluyla sabitledikten sonra, 4 °C'de yaklaşık 10 mililitre formaldehit içerisinde iki saat boyunca post-fiksasyona tabi tutun. Beyni 4 °C'de, bir vibratör kullanarak 10'ar dakikalık üç yıkama ile 1X PBS içerisinde yıkayın ve buz soğukluğundaki 1X PBS'den hemen sonra beyni 50 mikronluk transvers kesitler halinde dilimleyin.

Seçilen kesitleri, 4 °C'ye ayarlanmış XPBS ile doldurulmuş bir cam şişeye aktarmak için ince bir fırça kullanın. Kalan kesitleri, herhangi bir bozulma olmadan birkaç yıla kadar saklamak için -20 °C'de Kriyoprotektan içerisinde muhafaza edin. Her bir cam şişede, boyama için en fazla 10 adet serbest yüzen kesiti işleyin.

Kesitlerin kurumasını önlemek için çözeltileri hızlıca değiştirerek, transfer pipeti yardımıyla 1X PBS'yi taze %0,1 Sodyum borohidrür içeren PBS ile değiştirin. 30 dakika inkübe edin, ardından kesitleri 1X PBS ile 10'ar dakikadan 3 kez durulayın. Tüm hava kabarcıklarını giderdiğinizden emin olarak, kullanılacak ikincil antikora uygun %0,5 jelatin ve %5 normal serum içeren 1X PBS bloğu ekleyin.

İki saat boyunca inkübe edin. Bloklama solüsyonunda seyreltilmiş primer antikoru ekleyin. 48 saat boyunca inkübe edin.

1X PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez durulayın. Her birini, bloklama solüsyonunda seyreltilmiş biotin konjuge ikincil antikor ile iki saat boyunca inkübe edin. Daha önce olduğu gibi 1X PBS ile 10 dakika boyunca üç kez durulayın.

Bloklama solüsyonunda seyreltilmiş streptavidin horseradish peroksidaz ile bir saat boyunca inkübe edin. Kesitleri bir kez 1X PBS ile ve iki kez 1X TBS ile onar dakika boyunca durulayın. İşaretlemeyi görünür kılmak için kesitleri, 1X TBS içerisinde %0,05 dab ve %0,01 hidrojen peroksit içeren taze hazırlanmış bir solüsyon ile inkübe edin.

Boyama gözle görülür şekilde koyu kahverengi olduğunda veya reaksiyon beş dakika sürdüğünde, reaksiyonu durdurmak için kesitleri bir adet XTBS ile durulayın. Ardından bir kez bir adet XTBS ile ve iki kez, her biri 10 dakika boyunca bir adet x PB ile durulayın. Çeker ocak altında, kesitleri bir adet XPB ile doldurulmuş çok kuyucuklu bir kültür plağına aktarmak için ince bir fırça kullanın.

Kesişlerin hemen düzleşmesini sağlamak için ince bir fırça kullanarak bir kuyucuktaki PB'yi uzaklaştırın. Bir sonraki kuyucuğa geçmeden önce, 1x PB içinde %1 osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. OSM kesişlerini cam şişelere aktarın.

Üç kez 10 dakika boyunca bir XPB ile durulayın. Kesitleri artan etanol konsantrasyonlarındadehidre edin. Ardından, bu protokolün metin kısmında açıklandığı şekilde propilen oksit uygulayın.

Kesitleri taze hazırlanmış dupant reçinesine aktarmak için propilen oksit ile durulanmış ince bir fırça kullanın. Gece boyu sürecek impregnasyon için, kesitlerin bulunduğu kabı 55 degree Celsius'lik bir fırında 10 dakika bekletin. Reçineyi yumuşatmak için, bir chlor gömme filmini ince bir reçine tabakasıyla kaplamak amacıyla propilen oksit ile durulanmış bir fırça kullanın.

Kesiti filmin üzerine aktarın ve üzerini başka bir gömme filmiyle kapatın. Reçinenin yayılmasına yardımcı olmak için üzerine yaklaşık iki gramlık hafif ağırlıklar eşit şekilde dağıtın. Reçinenin bir inkübatörde 55 °C'de 48 ila 72 saat boyunca polimerize olmasını sağlayın. Polimerizasyondan sonra, üst gömme filmi tabakasındaki ağırlıkları bir binoküler mikroskop altında kaldırın.

İkiye iki milimetrelik ilgi alanları seçin ve bunları filmden çıkarmak için bir jilet kullanın. İlgi alanlarını reçine bloklarının uçlarına hızlı yapıştırıcı ile sabitleyin. 55 derece Celsius sıcaklıktaki inkübatörde bir saat boyunca kürleyin.

Rezin bloğu, ultra ince vakumlamaya en uygun şekil olan ikizkenar yamuk formuna getirmek için bir jilet kullanın. Düz bir yüzey elde etmek için mikrotom ve cam bıçak kullanarak doku yüzeyindeki yapıştırıcıyı temizleyin. Vakumlama işlemi için.

Cam bıçağın teknesini çift distile su ile doldurun ve 0,5 ile bir mikron arasında birkaç kesit alın. Kesitleri super frost lam üzerine aktarmak için mükemmel bir loop kullanın. 80 °C sıcaklıktaki ısıtma plakasında bir dakika boyunca kurutun ve %0,1 toluidine blue ile bir dakika boyunca boyayın.

Fazla boyayı çift distile su ile durulamak için bir püskürtme şişesi kullanın. Boyanmış dokuyu rezinden ayırt etmek için kesitleri ışık mikroskobu altında inceleyin. Doku ile resin arasındaki sınır, kesitin yaklaşık ortasına ulaşana kadar yarı ince kesitler alın. Cam bıçağı elmas bıçakla değiştirin ve tekneyi çift distile su ile doldurun.

Gümüşü ultra ince gümüş altın şeklinde kesin. 60 ila 80 nanometre kalınlığında kesitler alın. Kesitleri bakır tel ağlı ızgaralar üzerine dikkatlice toplamak için ince ters cımbız kullanın.

Kontrastı artırmak için ızgaraları filtre kağıdı üzerinde kurutun. Bir ızgarayı iki dakika boyunca bir damla kurşun sitrata aktarmak için ince uçlu ters cımbız kullanın. Izgarayı, çift distile su içeren birbirini izleyen üç banyoya daldırarak nazikçe durulayın.

Izgarayı filtre kağıdı üzerinde kurulayın ve daha sonra elektron mikroskobunda incelemek üzere bir ızgara kutusunda saklayın. İmmün boyamayı ve ayrıca hücresel elementlerin morfolojisini görselleştirmek için ızgaraları elektron mikroskobunda inceleyin. Bunlar hücre içi organeller ve birbirleriyle olan ilişkileridir.

Burada, IBA1 için ışık mikroskobu düzeyindeki temsili immün boyama gösterilmiştir. IBA1'in hücresel dağılımı mikroglia ile sınırlıdır, bu da elektron mikroskobu düzeyindeki özgüllüğünü doğrulamaktadır. IBA1 ile immün boyanmış mikroglial perikarion ve uzantıları görülmektedir.

İmmünoperoksidaz DAB boyaması, elektron yoğun bir çökelek olarak görülür. IBA1 immün boyamalı mikroglial uzantıların diğer örnekleri farklı boyut ve şekiller sergiler. Daha yüksek büyütme, mikroglial uzantılardan birinin içindeki çeşitli hücre içi organelleri ve ayrıca başka bir mikroglial uzantı ile sinapslar da dahil olmak üzere nöropilin yakındaki elementleri arasındaki ultra yapısal ilişkileri ortaya çıkarır.

Fare beyin dokusunun immüno elektron mikroskopi için nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, tüm adımların titizlikle takip edilmesinin ve beyin dokusunun nazikçe işlenmesinin önemli olduğunu unutmayın. Şimdilik bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.