Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, fare beyin dokusunu immün elektron mikroskobisi için hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle hayvanın perfüzyonu yoluyla beynin fikse edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, beynin kesilmesi ve kesitlerin immünohistokimya için işlenmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, kesitlerin osmiyumlanması, dehidratasyonu ve gömülmesidir. Prosedürün son adımı ise ultra ince kesitlerin alınmasıdır. Nihayetinde, merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerindeki ve hücre tiplerindeki çeşitli proteinlerin dağılımını yüksek uzamsal çözünürlükte gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'ndeki Esca Laboratuvarı'ndan Maria Trombley. Bugün size, immün elektron mikroskobisi için fare beyin dokusu hazırlama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, gelişim, deneyime bağlı plastiklik ve yaşlanma sırasında mikroglia ve sinapslar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Fare beynini intrakardiyak perforasyonla sabitledikten sonra, 4 °C'de yaklaşık 10 ml formaldehit içinde iki saat boyunca post-fiksasyona tabi tutun. Beyni 4 °C'de, bir vibratör kullanarak her yıkama 10 dakika sürecek şekilde üç kez 1X PBS ile yıkayın ve ardından hemen buz soğukluğundaki 1X PBS ile beyni 50 µm'lik transvers kesitler halinde dilimleyin.

Seçilen kesitleri, 4 °C'ye ayarlanmış 1X PBS ile doldurulmuş bir cam flakona aktarmak için ince bir fırça kullanın. Kalan kesitleri, herhangi bir bozulma olmadan birkaç yıla kadar saklamak için -20 °C'de kriyoprotektan içinde muhafaza edin. Her bir cam flakonla boyama işlemi için maksimum 10 serbest yüzen kesiti işleyin.

Kesitlerin kurumasını önlemek için çözeltileri hızlıca değiştirerek, transfer pipeti yardımıyla 1X PBS'yi taze 0.1% Sodyum borohidrür içeren PBS ile değiştirin. 30 dakika inkübe edin, ardından kesitleri 1X PBS ile her biri 10 dakika sürecek şekilde 3 kez durulayın. Tüm hava kabarcıklarını temizlemeye dikkat ederek, ikincil antikorla uyumlu 0.5% jelatin ve %5 normal serum içeren 1X PBS ekleyin.

İki saat boyunca inkübe edin. Bloklama çözeltisi ile seyreltilmiş primer antikoru ekleyin. 48 saat boyunca inkübe edin.

1X PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez durulayın. Her birini, bloklama çözeltisinde seyreltilmiş biyotin konjuge ikincil antikor ile iki saat boyunca inkübe edin. Daha önce olduğu gibi 1X PBS ile 10 dakika boyunca üç kez durulayın.

Bloklama çözeltisi ile seyreltilmiş streptavidin horseradish peroxidase ile bir saat boyunca inkübe edin. Kesitleri bir kez 1X PBS ve iki kez 1X TBS içerisinde, her biri 10 dakika olacak şekilde durulayın. Etiketlemeyi görünür kılmak için kesitleri, 1X TBS içerisinde %0,05 dab ve %0,01 hidrojen peroksit içeren taze hazırlanmış bir çözelti ile inkübe edin.

Boyama belirgin şekilde koyu kahverengi olduğunda veya reaksiyon beş dakika sürdüğünde, reaksiyonu durdurmak için kesitleri bir adet XTBS ile durulayın. Ardından bir kez XTBS ile ve iki kez, her biri 10 dakika boyunca bir x PB ile durulayın. Bir çeker ocak altında, kesitleri bir XPB ile doldurulmuş çok kuyucuklu kültür plağına aktarmak için ince bir fırça kullanın.

Kesitleri hemen düzleştirmek için ince bir fırça kullanarak bir kuyucuktaki PB'yi uzaklaştırın. Bir sonrakine geçmeden önce, 1x PB içinde %1 osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. OSM kesitlerini cam şişelere aktarın.

Üç defa 10 dakika boyunca bir XPB ile durulayın. Kesitleri artan etanol konsantrasyonları ile dehidrate edin. Ardından, bu protokolün metin kısmında açıklandığı şekilde propilen oksit uygulayın.

Kesişleri taze hazırlanmış dupant reçinesine aktarmak için propilen oksit ile durulan ince bir fırça kullanın. Gece boyunca sürecek impregnasyon için, kesişlerin bulunduğu kabı 10 dakika boyunca 55 °C'lik bir fırına yerleştirin. Reçineyi yumuşatmak için, propilen oksit ile durulanan bir fırça kullanarak klor gömme filmini ince bir reçine tabakasıyla kaplayın.

Kesiti filmin üzerine aktarın ve üzerini başka bir gömme filmi ile kapatın. Reçinenin yayılmasına yardımcı olmak için üzerine yaklaşık iki gramlık hafif ağırlıklar eşit şekilde dağıtın. Reçinenin bir inkübatörde 55 °C'de 48 ila 72 saat boyunca polimerleşmesini sağlayın. Polimerizasyondan sonra, üst gömme filmi tabakasındaki ağırlıkları binoküler mikroskop altında kaldırın.

İkiye iki milimetrelik ilgi alanları seçin ve bunları filmden çıkarmak için bir jilet kullanın. İlgi alanlarını reçine blokların uçlarına hızlı yapıştırıcı ile sabitleyin. 55 °C'lik inkübatörde bir saat boyunca kürleyin.

Rezin bloğu, ultra ince vakumlama için en uygun şekil olan ikizkenar yamuk formuna getirmek için bir jilet kullanın. Düz bir yüzey elde etmek için mikrotom ve cam bıçak yardımıyla doku yüzeyindeki yapıştırıcıyı temizleyin. Vakumlama işlemi için.

Cam bıçağın teknesini çift distile su ile doldurun ve 0,5 ile bir mikron arasında birkaç kesit alın. Kesitleri super frost lama aktarmak için mükemmel bir loop (ilmek) kullanın. 80 °C'lik bir ısıtıcı plaka üzerinde bir dakika boyunca kurutun ve bir dakika boyunca %0,1 toluidine blue ile boyayın.

Fazla boyayı çift distile su ile durulamak için bir püskürtme şişesi kullanın. Boyanmış dokuyu reçineden ayırt etmek için kesitleri ışık mikroskobu altında inceleyin. Doku ve reçine arasındaki sınır kesitin yaklaşık ortasına ulaşana kadar yarı ince kesitler alın. Cam bıçağı elmas bıçakla değiştirin ve tekneyi çift distile su ile doldurun.

Gümüşten ultra ince gümüş altın kesitler elde edin. 60 ila 80 nanometre kalınlığında kesitler alın. Kesitleri bakır ağ örgü ızgaralar üzerine dikkatlice toplamak için ince ters cımbız kullanın.

Kontrastı artırmak için gridleri filtre kâğıdı üzerinde kurutun. Bir gridi iki dakika boyunca kurşun sitrat damlasına aktarmak için ince ters cımbız kullanın. Gridi, ardışık üç çift distile su banyosuna daldırarak nazikçe durulayın.

Gridi filtre kağıdı üzerinde kurulayın ve daha sonra elektron mikroskobunda incelemek üzere bir grid kutusunda saklayın. İmmün boyamayı ve aynı zamanda hücresel elementlerin morfolojisini görselleştirmek için gridleri elektron mikroskobunda inceleyin. Bunlar hücre içi organeller ve bunların birbirleriyle olan ilişkileridir.

Burada, IBA one için temsilci bir immün boyama ışık mikroskobu düzeyinde gösterilmiştir. IBA one'ın hücresel dağılımı mikroglialarla sınırlıdır ve bu durum, elektron mikroskobu düzeyindeki özgüllüğünü doğrulamaktadır. IBA one ile immün boyanmış mikroglial perikaryon ve uzantılar görülmektedir.

İmmunoperoksidaz DAB boyaması, elektron yoğun bir çökelek olarak görülür. IBA1 immün boyalı mikroglial süreçlerin diğer örnekleri, farklı boyut ve şekiller sergilemektedir. Daha yüksek büyütme, mikroglial süreçlerden birinin içindeki çeşitli hücre içi organelleri ve ayrıca başka bir mikroglial süreç ile sinapslar dahil olmak üzere nöropilin yakınındaki elementler arasındaki ultrastrüktürel ilişkileri ortaya çıkarmaktadır.

Size fare beyin dokusunun immün elektron mikroskopi için nasıl hazırlanacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, tüm adımları titizlikle takip etmenin ve beyin dokusunu hassas bir şekilde işlemenin önemli olduğunu unutmayın. İşte hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.