Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, fare beyin dokusunu immünoelektron mikroskobu için hazırlamaktır. Bu, önce hayvanın bolluğu yoluyla beynin sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, beynin kesilmesi ve immünohistokimya bölümlerinin işlenmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, bölümleri ossec, dehidre etmek ve gömmektir. İşlemin son adımı, ultra ince kesitleri kesmektir. Sonuç olarak, yüksek uzamsal çözünürlükte, çeşitli proteinlerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgeleri ve hücre tipleri içindeki dağılımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'ndeki Esca Laboratuvarı'ndan Maria Trombley. Bugün size immünoelektron mikroskobu için fare beyin dokusunun hazırlanması için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, gelişim, deneyime bağlı plastisite ve yaşlanma sırasında mikroglia ve sinapsis arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Fare beynini intrakardiyak perfüzyon sonrası ile sabitledikten sonra, iki saat boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 10 mililitre formaldehit içinde sabitleyin. Beyni dört santigrat derecede yıkayın, her yıkamada 10 dakika boyunca bir XPB S3 kez, bir vibratör kullanarak ve buz gibi soğuk bir XPBS beyni hemen enine 50 mikronluk bölümler halinde dilimleyin.

Seçilen bölümleri dört santigrat derece ile doldurulmuş bir cam şişeye aktarmak için ince bir fırça kullanın. Bir XPBS, kalan bölümleri eksi 20 santigrat derecede Kriyoprotektan'da değişiklik yapmadan birkaç yıla kadar saklar. Her bir cam şişede boyama için en fazla 10 serbestçe yüzen bölüm işleyin.

Bölümlerin kurumasını önlemek için bir XPBS'yi PBS değiştirme solüsyonlarında taze %0,1 Sodyum boal hidrit ile değiştirmek için bir transfer pipeti kullanın. 30 dakika inkübe edin, bölümleri bir XPB S3 ile her biri 10 dakika durulayın. Kullanılacak ikincil antikora uygun %0.5 jelatin ve %5 normal serum içeren tüm baloncuk bloklarını ve bir XPBS'yi çıkarmaya özen gösterin.

İki saat kuluçkaya yatırın. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin. 48 saat kuluçkaya yatırın.

Bir XPB S3 ile 10 dakika boyunca durulayın. Her biri, iki saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotin konjuge ikincil antikor ile inkübe edilir. Daha önce olduğu gibi bir XPBS'de üç kez 10 dakika durulayın.

Bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş streptavidin yaban turpu peroksidaz ile inkübe edin. Bölümleri bir XPBS'de bir kez ve bir XTBS'de iki kez 10 dakika durulayın. Etiketlemeyi ortaya çıkarmak için, bölümleri bir XTBS'de %0.05 dab ve %0.01 hidrojen peroksit içeren yeni hazırlanmış bir çözelti ile inkübe edin.

Lekelenme gözle görülür şekilde koyu kahverengi olduğunda veya reaksiyon beş dakika sürdüğünde, reaksiyonu durdurmak için bölümleri bir XTBS ile durulayın. Daha sonra her biri 10 dakika boyunca bir XTBS ile bir kez ve bir x PB ile iki kez durulayın. Çeker ocakta, bölümleri bir XPB ile doldurulmuş çok kuyulu bir kültür plakasına aktarmak için ince bir fırça kullanın.

Bölümleri hemen düz bir şekilde yaymak için ince bir fırça kullanarak PB'yi bir kuyudan çıkarın. Bir sonrakine geçmeden önce bir x PB'ye% 1 osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iyice inkübe edin. OSM bölümlerini cam şişelere aktarın.

Bir XPB ile üç kez 10 dakika durulayın. Bölümleri artan etanol konsantrasyonlarında kurutun. Daha sonra bu protokolün metin bölümünde açıklandığı gibi propilen oksit.

Bölümleri taze hazırlanmış dupant reçinesine aktarmak için propilen oksitle durulanmış ince bir fırça kullanın. Gece boyunca emprenye etmek için, bölümleri içeren tabağı 10 dakika boyunca 55 derecelik bir fırına koyun. Reçineyi yumuşatmak için, bir klor gömme filmini ince bir reçine tabakasıyla kaplamak için propilen oksit ile bir fırça ile durulama kullanın.

Kesiti filmin üzerine aktarın ve başka bir gömme filmle eşit şekilde örtün: Reçinenin yayılmasına yardımcı olmak için yaklaşık iki gramlık hafif ağırlıkları üstüne dağıtın. Reçinenin bir inkübatörde 48 ila 72 saat boyunca 55 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin. Polimerizasyondan sonra, bir binoküler mikroskop altında gömme filminin üst katmanındaki ağırlıkları çıkarın.

İkiye iki milimetrelik ilgi alanlarını seçin ve bunları filmden çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Reçine bloklarının uçlarına ilgi alanlarını süper yapıştırın. 55 santigrat derece inkübatörün bir saat kürlenmesi.

Reçine bloğunu, ultra ince emme için en uygun şekil olan ikizkenar yamuk şeklinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Bir mikrotom ve bir cam bıçak kullanarak, düz bir yüzey elde etmek için dokunun yüzeyindeki yapıştırıcıyı çıkarın. Emme için.

Cam bıçağın teknesini çift distile su ile doldurun ve 0,5 ile bir mikron arasında birkaç bölüm kesin. Süper don slaytındaki bölümleri aktarmak için mükemmel bir döngü kullanın. 80 santigrat derece ısıtma plakasında bir dakika kurutun, bir dakika boyunca maviye %0,1 oranında lekeleyin.

Fazla lekeyi çift damıtılmış su ile durulamak için bir fışkırtma şişesi kullanın Işık mikroskobu altında, leke dokusunu reçineden ayırt etmek için bölümleri inceleyin. Doku ve reçine arasındaki sınır yaklaşık olarak bölümün ortasına ulaşana kadar yarı ince kesitler kesin. Cam bıçağı bir elmas bıçakla değiştirin ve tekneyi çift damıtılmış suyla doldurun.

Gümüşü gümüş altına ultra ince kesin. 60 ila 80 nanometre kalınlığında bölüm. Bakır örgü ızgaralardaki bölümleri dikkatlice toplamak için ince ters çevrilmiş cımbız kullanın.

Kontrastı artırmak için ızgaraları filtre kağıdı üzerinde kurutun. Bir ızgarayı iki dakika boyunca bir kurşun sitrat damlasına aktarmak için ince ters çevrilmiş cımbız kullanın. Art arda üç çift damıtılmış su banyosuna daldırarak ızgarayı nazikçe durulayın.

Izgarayı filtre kağıdı üzerinde kurutun, daha sonra elektron mikroskobunda incelemek için bir ızgara kutusunda saklayın. İmmün boyamayı ve aynı zamanda hücresel elementlerin morfolojisini görselleştirmek için elektron mikroskobu üzerindeki ızgaraları inceleyin. Bunlar hücre içi organeller ve birbirleriyle olan ilişkileridir.

Burada, IBA için temsili immün boyama ışık mikroskobik düzeyde gösterilmiştir. IBA'nın hücresel dağılımı, elektron mikroskobik düzeyde özgüllüğünü doğrulayan mikroglia ile sınırlıdır. IBA bir, immün boyalı mikroglial perik karyon ve süreçler görülebilir.

İmmünoperoksidaz DAB boyaması, elektron yoğun bir çökelti olarak görünür. IBA birin diğer örnekleri, immüno-lekeli mikroglial süreçler farklı boyutlar ve şekiller gösterir. Daha yüksek büyütme, mikroglial süreçlerden birinin içindeki çeşitli hücre içi organelleri ve ayrıca başka bir mikroglial süreç ile sinapslar da dahil olmak üzere yakındaki nöro hap unsurları arasındaki ultra yapısal ilişkileri ortaya çıkarır.

Az önce size fare beyin dokusunu immünoelektron mikroskobu için nasıl hazırlayacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, tüm adımları titizlikle takip etmeyi ve beyin dokusunu hassas bir şekilde manipüle etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.