JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:19 dk • April 30th, 2023
Lentivirus, RNA genetik materyali içeren bir Retrovirüstür. Bu virüs, transgenleri kanser hücre hatlarına sokmak için verimli ve kararlı bir yöntem sağlar. Yeşil floresan proteini veya GFP'yi eksprese eden Lentivirus içeren bir tüpe nöraminidaz ekleyerek başlayın. Virüsün bağlanma verimliliğini artırmak için tüpü bir saat boyunca 37 santigrat derecede tutun.
Daha sonra, bir pelet oluşturmak için tümör hücresi süspansiyonu içeren bir tüpü santrifüjleyin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için polibren içeren mamosfer ortamı ekleyin. Polibren, Lentiviral enfeksiyon etkinliğini artıran katyonik bir polimerdir. Şimdi altı oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına en uygun tümör hücresi sayısını plakalayın. Kültür plakasının her bir oyuğuna gerekli miktarda Lentivirus ekleyin.
İçeriği karıştırmak için plakayı döndürün ve sürekli bir karbondioksit kaynağı ile 96 saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Lentivirus hücreye girer ve RNA'yı serbest bırakır. Viral ters transkriptaz, RNA'yı konakçı genomuna entegre olan çift sarmallı DNA'ya dönüştürür. Plakayı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve başarılı transdüksiyon için hücreleri izleyin. Dönüştürülen hücreler, GFP ekspresyonu nedeniyle floresan olur.
Örnek protokolde, PDX ile ayrışmış tümör hücrelerinin Lentiviral vektörler ile transdüksiyonunu gerçekleştireceğiz.
Tümör hücrelerini dönüştürmek için, izole edilmiş hücreleri iki mililitre mamosfer ortamında yeniden süspansiyon için santrifüjleyin. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti 20 mikrolitre polibren ile desteklenmiş iki mililitre mamosfer ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, ultra düşük yapışmalı altı kuyulu doku kültürü plakası ve Lentiviral partikülleri 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda hücrelere uygun olarak kuyu başına 10 ila beşinci canlı tümör hücresine plaka koyun.
Virüsü hücrelerle karıştırmak için plakayı döndürün ve ko-kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 96 saate kadar inkübe edin ve ilk 24 saatten sonra 500 mikrolitre taze mamosfer ortamı ekleyin. Hücrelerin en az% 10'u GFP pozitif olduğunda, dönüştürülen hücreleri en az bir kuyudan buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve kuyuyu bir mililitre mamosfer ortamı ile yıkayın.
Yıkamayı hücrelerle birleştirin ve tümör hücrelerini 10 mililitre HBSS artı HEPES içinde santrifüjleyin. Son olarak, hücreleri buz üzerinde 50 mikrolitre bazal matris ekstraktında yeniden süspanse edin ve gömülü hücreleri yeniden implantasyon için 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin.