Yumuşak Agar Koloni Oluşumu Deneyi: Yeni Bileşiklerin Kanser Hücresi Proliferasyonu Üzerindeki Etkilerini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Başlamak için, konik bir tüpte uygun bir erimiş agaroz konsantrasyonu alın ve buna istenen miktarda ılık kültür ortamı ekleyin. İçeriği karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Bu karışımı altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ekleyin ve katılaşmasına izin verin. Bu alt katmandır. Daha sonra, kanser hücrelerini ilgilenilen bileşik ile tedavi edin ve gerekli agaroz konsantrasyonunu ekleyin.

Şimdi, mililitre başına istenen sayıda hücre içeren bu karışımı her bir kuyucuğa dökün. Bu hücre içeren bir katmandır. Ortam katılaştıktan sonra, plakayı bir hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Agarozu ortama karıştırarak bir besleyici tabaka hazırlayın ve bu karışımı ilgilenilen bileşikle tamamlayın. Bu besleyici tabakayı yavaşça her bir oyuğa ekleyin, katılaşmasına izin verin ve plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Koloniler oluşana kadar hücreleri ortamla yenilemek için bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın. İlgilenilen bileşik bir tümörjenite inhibitörü ise, hücrelerin büyümesini baskılayacak ve kuyucuklarda az sayıda koloni oluşmasına neden olacaktır. Aşağıdaki protokolde, PADI inhibitörlerinin meme kanseri hücrelerinin tümörjenitesi üzerindeki etkisini incelemek için yumuşak bir agar koloni oluşumu testi yapacağız.

Bu işleme %3 2-hidroksietil agaroz hazırlayarak başlayın. Temiz, kuru 100 mililitrelik bir cam şişeye 0.9 gram 2-hidroksietil agaroz ve ardından 30 mililitre damıtılmış su ekleyin. Karışımı 15 saniye mikrodalgada ısıtın ve hafifçe döndürün. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, şişe içeren çözeltiyi 15 dakika boyunca otoklavlayın.

Daha fazla kullanmadan önce agaroz çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Tutarken agarozun pipette katılaşmasını önlemek için birkaç beş mililitre ve 10 mililitrelik pipeti 37 santigrat derecelik bir inkübatörde önceden ısıtın. Şişe kapağını kısmen gevşetin ve önceden hazırlanmış %3 2-hidroksietil agaroz çözeltisini 15 saniye mikrodalgada ısıtın. Ardından çözeltiyi ve mikrodalgayı 15 saniye daha yavaşça döndürün.

Agaroz çözeltisini döndürürken dikkatli olun çünkü çözelti havaya maruz kaldığında yükselir ve dökülebilir. Şişede artık katı jel varsa, birkaç saniye daha mikrodalgada pişirin. Agaroz çözeltisinin erken katılaşmasını önlemek için sonraki adımlarda agaroz çözeltisini içeren şişeyi 45 santigrat derece su banyosunda tutun.

Ardından, önceden ısıtılmış pipetleri kullanarak 12 mililitre ısıtılmış ortamı steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hemen %3'lük agaroz çözeltisinden üç mililitre ekleyin ve agarozu ortamla karıştırmak için konik tüpü hafifçe ters çevirin. Daha sonra, herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan altı oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna bu karışımdan iki mililitre yavaşça ekleyin. Karışımın katılaşmasına izin vermek için altı oyuklu kültür plakasını düz bir yüzeyde dört santigrat derecede bir saat boyunca yatay olarak inkübe edin.

Karışım katılaştıktan sonra, plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Alt katman artık kullanıma hazırdır.

Bu prosedürün zor bir yönü, sıvı agaroz jeli eklenmeden önce hücrelerin ortamda karıştırılmasını sağlamak için tüm hücrelerin eşit olarak dağıldığından ve erimiş agaroz jelin her bir oyuğa eklenmeden önce katılaşmadığından emin olmaktır. Ek olarak, kullanım sırasında çözeltilerin katılaşmasını önlemek için pipetler önceden ısıtılır.

Hücre içeren tabakayı hazırlamak için, önce MCF10DCIS hücreleri tripsinize edin ve mililitre başına 40.000 hücrelik bir hücre konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra önceden ısıtılmış pipetler kullanarak sekiz mililitre ortam alın ve steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Konik tüpe hemen iki mililitre% 3 agaroz ekleyin ve agarozu ortamla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının.

Daha sonra, hücrelerin iki mililitresini alın ve bunları DMSO'da iki mikromolar BB-klor-amidin veya kontrol olarak tek başına DMSO ile tedavi edin. İşlemi takiben, bir mikromolar BB-klor-amidin'in nihai konsantrasyonunu yapmak için hücreleri bire bir seyreltmede% 0.6'lık bir agaroz ile karıştırın. Daha sonra hücre-agaroz karışımından bir mililitre alın ve altı oyuklu kültür plakasının alt tabakasına yavaşça ekleyin.

Üst tabakanın katılaşmasını sağlamak için altı oyuklu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin. Karışım katılaştıktan sonra, besleme katmanını eklemeden önce plakayı bir hafta boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Önceden hazırlanmış %3'lük 2-hidroksietil agaroz çözeltisini daha önce olduğu gibi mikrodalgada pişirerek ve agaroz çözelti şişesini 45 santigrat derece su banyosunda dengeleyerek katman hazırlığına başlayın.

Bir mililitre% 3 agaroz çözeltisini dokuz mililitre ılık ortamla 50 mililitrelik konik bir tüpe karıştırın ve agarozu ortamla karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Karışımı BB-klor-amidin ile işlemden geçirdikten sonra, alt ve yumuşak katmanları içeren altı oyuklu kültür plakasının her bir oyuğuna yavaşça bir mililitre karışım ekleyin. Ardından, karışımın katılaşmasını sağlamak için altı oyuklu kültür plakasını en az 15 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeye yatay olarak yerleştirin.

Besleyici tabakası katılaştıktan sonra, plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Koloni oluşumu gözlenene kadar hücreleri yeni ortamla doldurmak için mevcut besleyici tabakanın üzerine bir mililitre% 0.3 agaroz ortam muamele solüsyonu yerleştirerek bu besleme prosedürünü haftalık olarak tekrarlayın.