Metabolomik için Numune Hazırlama: Metabolit Profili Oluşturma için Hücre Numuneleri Hazırlama Yöntemi

Metabolomik, hücrelerde bulunan metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için yapılan çalışmadır. Numuneyi hazırlamak için, meme kanseri hücrelerini büyüme ortamı ile birlikte test ve kontrol olarak etiketlenmiş iki plakaya ekerek başlayın. 37 santigrat derecede üç gün inkübe edin. Şimdi, ortamı çıkarın ve test plakasına estradiol ve kontrol plakasına düz ortam ile taze ortam ekleyin.

Östradiol, meme kanseri hücrelerinde östrojen reseptörü alfa'ya bağlanarak belirli ekspresyonları indükleyerek metabolit bileşiminde bir değişikliğe neden olur. Plakaları istenen süre boyunca inkübe edin. Hücreleri yıkamak için ortamı buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ile değiştirin ve ardından buz gibi soğuk aseton ekleyin. Buz gibi soğuk reaktifler, proteazların etkisini durdurur ve böylece protein bozulmasını önler.

Şimdi hücreleri plakalardan ayırmak için bir kazıyıcı kullanın ve bunları bir pipet yardımıyla tüplere aktarın. Bu hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini bir hemositometreye alın ve hücre sayısını sayın. Numuneleri daha fazla analiz için kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aşağıdaki protokolde, gaz kromatografisi ve kütle spektrometresi için MCF-7 hücrelerinden örnekler hazırlıyoruz.

Metin protokolüne göre kültürlenmiş MCF-7 hücrelerini kullanarak, plakaya beş mililitre buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin. Ardından PBS'yi çıkarmadan önce plakayı birkaç kez eğin. Son yıkamadan sonra mümkün olduğunca fazla PBS'yi kaldırarak iki kez daha tekrarlayın. Her plakaya 750 mikrolitre önceden soğutulmuş aseton ekleyin ve hücreleri kazıyın, ardından hücreleri iki plakadan buz üzerinde iki mililitrelik bir tüpte birleştirin.

Normalizasyon için hücreleri saymak için, her tedavi için hücre ölçümü için iki ekstra plaka kullanın. Daha sonra hücreleri plakalardan ayırmak için 2 mililitre HE tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. HE tamponunda pipetleyerek hücreleri iyice karıştırın.

Daha sonra mikroskop altında hücre sayısını saymak için bir hemositometrede 20 mikrolitre hücre çözeltisi kullanın. Metabolitleri tanımlamak ve miktarını belirlemek için gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizini kullanmadan önce numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Metin protokolüne göre bütünleştirici analiz yapın.