JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:55 dk • April 30th, 2023
- İlk olarak, ötenazi yapılmış bir fareyi bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Karnın hemen üstünde, cildi ve karın zarını kesin. Diyaframı delin ve kaburgalar ve göğüs kafesi boyunca trakeaya kadar kesin. Trakeada küçük bir kesi oluşturun. Karinaya zarar vermeden trakeanın içine nazikçe bir iğne sokun ve forseps ile sabitleyin. Akciğerlerin içine normal vücut sıcaklığında düşük erime noktalı agaroz enjekte edin. Şırıngayı yavaşça çıkarın ve agarozun geri akışını önlemek için iğneyi içeride tutun.
Agaroz jelleşmesini teşvik etmek için akciğerlere soğuk PBS dökün. İğneyi çıkarın ve katılaşmamış agarozun geri akışını önlemek için trakeayı forseps ile sabitleyin. Sternumu kesin, trakeayı forseps ile tutun ve makas kullanarak kesin. Akciğerleri göğüs boşluğundan çıkarın. Ortamdaki lobları ayırın. Mikroskopi için fizyolojik koşullar altında görüntüleme kuyularının içine yerleştirin. Agaroz, canlı hücresel etkileşimleri gözlemlemeye yardımcı olan fizyolojik sıcaklıklarda akciğer morfolojisini korur. Aşağıdaki protokolde, kanser hücreleri ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için akciğerlerin ex vivo canlı görüntülemesini göstereceğiz.
- Akciğerleri ex vivo canlı görüntülemeye hazırlamak için, fareyi bir parça sağanak ile kaplı polistiren köpük bir kapak üzerinde hareketsiz hale getirerek başlayın ve hayvanı %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra, cerrahi makas kullanarak, deriden enine epigastrik bir kesi yapın, ardından peritondan benzer bir kesi yapın. Daha sonra, diseksiyon tahtasını dikey bir pozisyona getirin, inen aortu kesin, böylece kan göğüs boşluğuna değil karın içine toplanır.
Vakumu serbest bırakmak için diyaframda küçük bir açıklık açın, ardından diyaframı çıkarmak ve akciğerleri görselleştirmek için göğüs kafesini kesin. Cerrahi makas kullanarak, kaburgaları sağlam bırakarak göğüs kafesi üzerinden soluk borusuna kadar cildi kesin. Daha sonra cildi göğüs kafesinden ayırın ve trakeanın kendisine zarar vermemeye dikkat ederek trakeayı ortaya çıkarmak için çevredeki bağ dokusunu çıkarın. Açıkta kalan trakeada yaklaşık 1 milimetre çapında küçük bir açıklık açın, kıkırdak halkalarına paralel olarak gırtlağa mümkün olduğunca yakın, trakeayı tamamen kesmeden kesin.
Ardından, 20 gauge bir iğneyi herhangi bir karşı kuvvet olmadan trakeaya 4 ila 5 milimetre yavaşça sokun. İğnenin ucu trakeadan görülebilmelidir. Bir şırıngayı 400 mikrolitre 37 santigrat derece %2 düşük erime sıcaklığı agaroz ile doldurun ve ardından iğneyi forseps ile stabilize edin. Diseksiyon tahtasını dikey tutarak, tüm ılık agaroz miktarını iğneden akciğerlere yavaşça aşılayın. Akciğerler şişirildikten sonra, iğneyi trakeanın içinde tutarken şırıngayı çıkarın ve agarozun sertleşmesine yardımcı olmak için akciğerlerin üzerine yaklaşık 50 mililitre 20 santigrat derece PBS dökün.
Agaroz katılaştığında, iğneyi çıkarın ve katılaşmamış agarozun sızmasını önlemek için trakeayı kapatmak için forseps kullanın. Şimdi sternotomi ile göğsü daha da açın ve soluk borusunu forseps ile kavrayın. Ardından, bir çift cerrahi makas kullanarak trakeayı tamamen kesin. Akciğerleri çıkarmak için trakeayı yavaşça yukarı çekin, bağ dokusunu ve yemek borusunu kesin ve akciğerleri göğüs boşluğundan tamamen dışarı çekin.
Fazla kanı yıkamak için dokuyu 37 Santigrat Derece RPMI 1640'a daldırın. Makas ve forseps kullanarak lobların ana gövde bronşlarını hilumdan kesin ve akciğer loblarını nazikçe ayırın. Lobları 24 oyuklu bir görüntüleme plakasının bir kuyucuğuna aktarın, düz bir yüzey aşağı doğru ve dokuyu 100 mikrolitre 37 santigrat derece RPMI 1640 ile kaplayın. Yüzmelerini önlemek için lobların üzerine birkaç adet 15 mililitrelik dairesel mikroskop kapak lamı yerleştirin ve ortamın buharlaşmasını önlemek için çevredeki kuyucuklara ılık PBS dökün. Daha sonra 24 oyuklu plakayı iklim odasına yerleştirin ve odayı konfokal mikroskop aşamasına aktarın.