Akciğer Karsinomu Hücrelerinin 3 Boyutlu Kültürü: Hücre-Matriks Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Yöntem

- İlk olarak, bazal membran matrisi şişelerini gece boyunca 4 santigrat derecede çözün. Bazal membran matrisi, kanser hücrelerinin özelliklerinin in vitro olarak korunmasına yardımcı olan tümör mikro çevresinde bulunan proteinlerden oluşur. Ertesi gün, matrisi sıvı halde tutmak için bazal membran matris şişesini buzun üzerine yerleştirin. Akciğer kanseri hücrelerini önceden soğutulmuş bir santrifüj tüpüne alın ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti yerinden çıkarmak ve buzun üzerine yerleştirmek için hafifçe vurun. Daha sonra, bu tüpe uygun hacimde bazal membran karışımı ekleyin ve homojen bir hücre süspansiyonu yapmak için karıştırın. Bodrum membranının jelleşmesini önlemek için tüm adımları düşük sıcaklıkta gerçekleştirin.

Uygun hacimde hücre matrisi süspansiyonunu, tüm kuyuyu kaplayan önceden soğutulmuş bir kuyu plakasında her bir oyuklu merkeze aktarın. Matrisin katılaşması için kuyu plakasını inkübe edin. Matris içindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için mikroskop altında inceleyin. Her bir oyuğa 3D kültür tam ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu ortam, hücre matrisi etkileşimlerini kolaylaştırır. Böylece hücreler asiner benzeri yapılara sahip organoidler oluşturur. Aşağıdaki protokolde TUM622 akciğer karsinomu hücrelerinin 3 boyutlu kültürünü gerçekleştireceğiz.

Başlamak için, bazal membran matrisi şişelerini gece boyunca 4 santigrat derece buzdolabında çözün. İki mililitrelik plastik pipeti ve uçları gece boyunca eksi 20 santigrat derecede soğutun. Ertesi gün, TUM622 hücrelerini, HEPES tamponunu, Tripsin-EDTA'yı ve Tripsin Nötralizasyon tamponunu ayırmak için kullanılan reaktifleri 37 santigrat derece su banyosunda ısıtın. Çözülmüş bazal membran matrisini buzdolabından çıkarın ve şişeyi buzun üzerine koyun. Doku kültürü plakalarını buz üzerine yerleştirilmiş metal platformlu bir soğutucuda soğutun. Santrifüj tüplerini buz üzerinde metal bir soğutma rafına yerleştirin. Hazırlanacak kuyu sayısına ve her kuyucuktaki hücre konsantrasyonuna bağlı olarak ihtiyaç duyulan hücre miktarını hesaplayın. TUM622 hücre süspansiyonunu soğutulmuş bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 4 santigrat derecede asılı bir kova santrifüjünde 300 kez g'de döndürün.

Filtrelenmemiş bir uca bağlı bir aspirasyon pipeti ile, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve tüpte yaklaşık 100 mikrolitre ortam bırakın. Peleti yerinden çıkarmak ve ilişkilendirmek için tüpün yan tarafına hafifçe vurun, ve ardından soğutma rafına geri koyun. Önceden soğutulmuş iki mililitrelik pipeti kullanarak, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek matrisi buz üzerinde nazikçe karıştırın. Bu prosedür sırasında matrise kabarcık girmemesi için eşit ve orta hızda pipetleyin.

Her bir santrifüj tüpüne 1.1 mililitre matris aktarın. Önceden soğutulmuş uçları kullanarak, düzgün bir hücre süspansiyonu elde etmek için matrisi her tüpte yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 310 mikrolitre hücre matrisi süspansiyonunu önceden soğutulmuş 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın. Pipeti plaka yüzeyine 90 derecelik bir açıyla yerleştirin ve süspansiyonu kuyunun ortasına ekleyin. Süspansiyon yayılır ve tüm kuyuyu kaplar. Aşağı akış immünofloresan analizini kolaylaştırmak için, 60 mikrolitre hücre matrisi süspansiyonunu 2 oyuklu bir oda slaytının kuyu merkezine aktarın. Bu, matrisin çok daha küçük hacimli kubbe benzeri bir yapı oluşturmasına izin verir.

Plakayı ve hazneyi tekrar doku kültürü inkübatörüne kaydırın ve matrisin katılaşmasını sağlamak için 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, plakayı inceleyin ve tek hücrelerin matris içinde eşit olarak dağıldığından emin olmak için bir ışık mikroskobu altında kaydırın. Plakanın her bir oyuğuna 1 mililitre önceden ısıtılmış 3D kültür tam ortamı ve hazne slaytının her bir oyuğuna 1,5 mililitre 3D kültür ortamı ekleyin. Sonra onları kuluçka makinesine geri koyun.