Akciğer Kanseri Hücrelerinin CAF'larla 3D Ko-kültürü: Tümör İlerlemesini İncelemek İçin İn Vitro Model Sistem

- 3D ko-kültürlerde, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştıran, doğal hücre dışı matris mikro ortamını taklit eden bir bazal membran matrisi gibi matrislerde birden fazla hücre tipi birlikte büyütülür. Gömülü bir 3D ko-kültür oluşturmak için, bazal membran matrisinde ikiye bir oranında alınan kanserle ilişkili fibroblastların veya CAF'lerin ve akciğer kanseri hücrelerinin tek tip bir süspansiyonunu hazırlayın. Ortam sıcaklıklarında matris katılaşmasını önlemek için süspansiyonu buz üzerinde tutun.

Uygun hacimde bir süspansiyonu bir hücre kültürü plakasına aktarın. Hücreleri matrise birlikte gömmek için gereken süre boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üst üste bindirilmiş bir 3D ko-kültür oluşturmak için, istenen hücre yoğunluğunda bazal membran matrisinde akciğer kanseri hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın. Süspansiyonu buz üzerinde tutun. Bu hücre matrisi süspansiyonunun uygun bir hacmini bir hücre kültürü plakasına pipetleyin. Gömülü kanser hücresi monokültürünü kurmak için 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, tercih edilen kültür ortamında süspanse edilen istenen CAF hacmini gömülü kanser hücrelerinin üzerine aktarın. 3D ko-kültürlerde, CAF'ler kanser hücrelerinin sferoid oluşumunu arttırır ve kanser hücrelerini çeker, bu da gözyaşı damlası benzeri yapılara neden olur. Bu protokolde, etkileşimlerini incelemek için TUM622 akciğer kanseri hücrelerini ve CAF'leri birlikte kültürleyeceğiz.

- TUM622 ve CAF'lerin hücre süspansiyonlarını hazırladıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırarak CAF hücre yoğunluğunu sayın. Hücre yoğunluğunu saymak ve hesaplamak için bir hemositometre üzerindeki iki odacıkların her birine 10 mikrolitre karışım ekleyin. TUM622 hücrelerini ve CAF'leri bazal membran matrisine birlikte gömmek için, önce hücre yoğunluğu bilgisine dayalı olarak kaplama için kullanılan istenen hücre sayısını hesaplayın. CAF'ler, TUM622 hücrelerinin 2'ye 1 oranında tohumlanır. Hesaplanan TUM622 hacmini ve CAF hücreleri süspansiyonunu aynı santrifüj tüpüne aktarın. Aşağı döndürün ve tüm ortamları aspire edin. Bodrum membran matrisi ve plakasında 310 mikrolitre karışımı 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yeniden süspanse edin. İmmünofloresan için, 60 mikrolitre TUM622 ve CAF karışımlarını daha önce tarif edildiği gibi oda slaytlarına aktarın.

TUM622'yi bazal membran matrisinde üst üste bindirilmiş CAF'larla birlikte kültürlemek için, önce daha önce açıklandığı gibi TUM622 monokültürünü kurun. CAF süspansiyonunun iki katını bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez 'g' de döndürün. Süpernatanı aspire edin ve CAF'leri bir mililitre 3D kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir mililitre CAF süspansiyonunu gömülü TUM622 hücrelerini içeren kuyuya aktarın.