Doz artırımı öncesinde IC50 belirlenmesi neden kritiktir?

MTT analizi yoluyla bazal IC50 değerinin belirlenmesi, doz artırımını 1/10 IC50 değerinde başlatmak için referans konsantrasyonu sağlayarak, anlık sitotoksisite oluşmadan seçici baskı uygulanmasını garanti eder. Bu durum, akut hücre ölümü yerine zaman içinde kademeli direnç gelişimine olanak tanır.

MTT deneyi çıktısı direnç gelişimine dair nasıl bilgi verir?

MTT deneyi, canlı hücrelerdeki mitokondriyal redüktaz aktivitesinden kaynaklanan formazan üretimini ölçer ve 570 nm'deki optik yoğunluk hücre sayısı ile korelasyon gösterir; hücreler, başlangıçta büyümeyi inhibe eden artan afatinib konsantrasyonlarında canlılıklarını koruduklarında direnç doğrulanmış olur.

Dirençli hücre hattı geliştirilmesinin güvenilir şekilde tekrarlanmasını ne sağlar?

Yarı akışkanlıkta (subconfluency), her pasajda %10-20 konsantrasyon artışları ile gerçekleştirilen kademeli doz artırımı, izojenik dirençli modeller oluşturmak için laboratuvarlar arasında tekrarlanabilen standart bir seçici baskı protokolü sağlar.

Çapraz fonksiyonlu iş birliği için replikasyon gereksinimleri neden temel öneme sahiptir?

Tekrarlar arasında tutarlı direnç gelişimi, gözlemlenen fenotiplerin stokastik değil, genetik kaynaklı olduğundan emin olunmasını sağlayarak; hedef doğrulama çalışmaları için keşif, analiz geliştirme ve preklinik ekipler arasında güvenilir bir geçiş imkanı sunar.

Direnç gelişimini onaylamak için hangi istatistiksel analiz gereklidir?

Direnç, parental hücreler ile artırılmış doz hücreleri arasında MTT analizi kaynaklı canlılık eğrilerinin karşılaştırılmasıyla doğrulanır ve zamanla azalan ilaç duyarlılığını kanıtlamak için istatistiksel anlamlılık testleri (örneğin, IC50 kayma analizi) gerektirir.

Doz Yükseltme: Kanser Hücrelerinde İlaç Direnci Geliştirmek İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 4:17 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Tirozin Kinaz İnhibitörleri, TKI, kinaz reseptörünün ATP'ye bağlanmasını engelleyerek fosforilasyonu önler. Kanser hücrelerini büyüme ortamında kaplamakla başlayın. Uygun yoğunluğa ulaşmalarına izin verin ve hücreleri birden fazla kuyuya aktarın. Gece boyunca büyüdükten sonra, farklı ilaç konsantrasyonlarını birden fazla oyuğa dağıtın ve hücrelerin istenen süre boyunca büyümesine izin verin. Hücre canlılığını ölçmek için suda çözünür bir boya olan MTT'yi ekleyin. Mitokondriyal enzimler, MTT'yi canlı hücrelerin içinde çözünmeyen mor formazana dönüştürür.

Uygun bir çözündürücü madde ekleyerek reaksiyonu durdurun ve formazı spektrofotometrik olarak ölçün. Bu yönteme MTT tahlili denir. İlaç konsantrasyonlarına karşı formazan ile gösterilen canlı hücrelerin bir grafiğini çizin. Yazılımı kullanarak hücrelerin %_50'sini öldüren ilaç konsantrasyonunu bularak inhibitör konsantrasyonu (IC 50) hesaplayın.

Daha sonra, büyüme ortamında kanser hücrelerini büyütün ve bunları üç farklı plakaya dağıtın. Hücreler alt birleşime ulaştıktan sonra, IC₅₀ konsantrasyonunun 1/10 seyreltmesini ekleyin. Hücrelerin büyümesine ve MTT testini gerçekleştirmesine izin verin. Bu işlemi artan ilaç dozu ile tekrarlayın. Kanserli hücreler, protein dizisindeki mutasyonlar nedeniyle yavaş yavaş TKI'lere karşı direnç geliştirir.

Aşağıdaki protokol, doz artışı ile PC9 hücrelerinde afatinib direncinin gelişimini göstermektedir.

- Uygun afatinib direnç konsantrasyonunu belirlemek için, PC9 hücrelerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 10 santimetrelik hücre kültürü ile muamele edilmiş bir kapta büyüme ortamında kültürleyin. PC9 hücrelerini, mililitre büyüme ortamı konsantrasyonu başına 4 kez 10 ila 4 hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri, 96 oyuklu bir mikroplakada oyuk başına 50 mikrolitre hücre süspansiyonunda tohumlayın. Hücre kültürü inkübatöründe bir gece inkübasyondan sonra, hücrelere belirtilen konsantrasyonların altı kopyasında kuyu başına 50 mikrolitre afatinib çözeltisi uygulayın. Hücre kültürü inkübatöründe 96 saatlik bir inkübasyondan sonra, her bir oyuğa 15 mikrolitre MTT boyası ekleyin.

Hücre kültürü inkübatöründe dört saat sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre çözündürme durdurma çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca inkübatöre geri koyun. Ertesi sabah, bir mikroplaka okuyucuda optik yoğunluğu 570 nanometrede ölçün. Sürekli afatinib maruziyeti için, hücreler alt birleşime ulaşana kadar 10 mililitre büyüme ortamı içeren P100 kaplarında PC9 hücrelerini kültürleyin.

Alt birleşen kültürleri, ilk kültür kabı başına 9 mililitre büyüme ortamından oluşan üç yeni P100 kabına aktarın ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, her üç kültür kabı setine 0.1 nanomolar veya yarım maksimal inhibitör afatinib konsantrasyonunun 1 / 10'unu ekleyin. Afatinib ile muamele edilen hücreler subkonfluent hale geldiğinde, kültürleri iyice karıştırmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın ve her tabaktan 1 mililitre hücreyi yeni P100 tabaklarında 9 mililitre taze büyüme ortamına aktarın.

Yeni kültürlere% 10 ila% 20 daha yüksek konsantrasyonlarda afatinib ekleyin, kültürler 10 ila 12 aylık bir süre boyunca her seferinde alt birleşime ulaştığında afatinib konsantrasyonunu kademeli doz artışıyla artırın. 1 mikromolar afatinib konsantrasyonuna ulaşıldığında, hücrelerin afatinib direnci geliştirdiğini doğrulamak için gösterildiği gibi MTT testini gerçekleştirin.