RNA Ekstraksiyon Testi: miRNA Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinden RNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

- Başlamak için, akciğer kanseri hücrelerini doku kültürü ortamı içeren bir T-şişesine tohumlayın ve gece boyunca büyümesine izin verin. Daha sonra, miRNA'yı bir transfekte edici ajan ile transfekte edici bir ortama süspanse edin. Ortamı çıkarın ve miRNA'yı kanser hücrelerine sokacak bir transfekte edici ortam ekleyin. miRNA, tamamlayıcı bir mRNA dizisine bağlanan ve gen ekspresyonunu bloke eden, kodlamayan bir RNA molekülüdür. Şişeyi istenen süre boyunca inkübe edin.

Ardından, besiyerini doku kültürü besiyeri ile değiştirin ve gece boyunca büyütün. Hücre ayrışması için tripsin ekleyin. Karışımı PBS içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve lizaz hücrelerine lizis tamponu ekleyin ve çökeltme için ultra saf etanol ekleyin. Nükleik asit ve santrifüjü saflaştırmak için karışımı bir ayırma kolonuna yerleştirin.

Akışı çıkarın ve parçalanmış hücre zarını ve santrifüjü çıkarmak için bir yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu çıkarın ve DNA'yı numuneden ve santrifüjden çıkarmak için DNaz sindirim tamponu ile DNaz ekleyin. RNA ve santrifüjü izole etmek için RNA hazırlık tamponu ekleyin. Süpernatantta bulunan RNA'yı toplayın. Aşağıdaki protokolde, miRNA ile tedavi edilmiş akciğer kanseri hücrelerinden RNA ekstraksiyonu yapacağız.

- İlk olarak, kanser hücrelerini, qPCR veya mikrodizi analizi kullanarak gen ekspresyonunu gerçekleştirmek için RNA ve protein ekstraksiyonu için yeterli olan uygun bir şişeye tohumlayın. Daha sonra% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş ortam ile gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, mikroRNA 143 ve mikroRNA 506'yı ortamda her biri 100 nanomolar konsantrasyonda seyrelterek mikroRNA örneğini transfeksiyon için hazırlayın. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve ortamı çıkarın. 1 x PBS ile yıkayın.

İşlenmemiş tüm kontroller yalnızca hücrelere sahip eksik ortam içerecektir. Hücreleri bir inkübatörde altı saat boyunca transfeksiyon ortamı ile inkübe edin. Altı saat sonra, ortamı çıkarın ve 4 mililitre taze tam ortamla değiştirin. Hücreleri 24 saat ve 48 saat sonra tripsinizasyon ile hasat edin.

Daha sonra her tüpte 1x PBS ile iki kez yıkayın ve süpernatanı çıkarın. RNA ekstraksiyonunu daha sonra gerçekleştirmek için hücreleri eksi 80 santigrat derecede dondurun.

- RNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA kiti kullanılarak gerçekleştirildi. Önce tüpleri eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve çözülmeye bırakın.

- 300 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve hücre zarını kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Eşit hacimde %100 ultra saf etanol ekleyin. Sonra iyice karıştırın ve ayırma sütununa yerleştirin. Santrifüjleyin ve içinden geçen akışı çıkarın.

Tamponu çıkarmak için 400 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve santrifüjleyin. Her numuneye 75 mikrolitre DNA sindirim tamponu ile 5 mikrolitre DNAse I ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneyi 400 mikrolitre RNA hazırlık tamponu ile yıkayın.

Daha sonra RNA yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Şimdi kolona nükleaz içermeyen su ekleyin, santrifüjleyin ve ardından RNA'yı toplayın. RNA konsantrasyonunu ölçün, bu aşamada RNA dizilimi için 2 mikrogram RNA örneği gönderilebilir.