Hücre Döngüsü Analizi: miRNA ile Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinin Hücre Döngüsü Düzenlemesini İncelemek İçin Bir Yaklaşım

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 3:34 dk • April 30th, 2023

- Bir mikroRNA veya miRNA, küçük, kodlamayan bir RNA'dır. mRNA transfeksiyonunu veya bir hücreye girişini takiben, bir miRNA protein kompleksi oluşturur. Kompleks, spesifik mRNA'yı hedefler ve ona bağlanır ve ekspresyonunu negatif olarak düzenleyerek hücre döngüsü ilerlemesini durdurur.

Analize başlamak için, miRNA ile transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerinin hasat edilmiş bir kültürüne uygun bir dehidrasyon fiksatifi ekleyin. Fiksatif hücreleri korur ve ayrıca hücre zarına nüfuz eder. Hücreleri propidyum iyodür, bir floresan nükleik asit boyası ve ribonükleaz enzimi karışımına tabi tutun.

Boya hücrelere girer ve hem DNA'yı hem de RNA'yı boyar. Enzimler, optimal DNA miktar tayinine izin vererek RNA'yı spesifik olarak bozar. Tek tek hücrelerin floresan yoğunluğuna bağlı olarak farklı hücre döngüsü fazlarında durdurulan hücrelerin oranını belirlemek için bir akış sitometresi kullanın.

Dinlenme ve büyüme aşamalarındaki hücreler daha düşük DNA içeriğine ve dolayısıyla daha düşük floresan yoğunluğuna sahiptir. Boşluk 2 fazındaki hücreler, iki kat daha fazla DNA miktarına sahip hücreler, iki kat daha fazla floresan yoğunluğu üretir. DNA sentez fazındaki hücreler, diğer iki popülasyon arasında bir floresan değeri indükler. Aşağıdaki protokol, PI boyama ve akış sitometrisi kullanarak DNA içeriğini ölçerek miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin hücre döngüsü regülasyonunu analiz edecektir.

- Hücreleri bu videonun önceki bölümünde anlatıldığı gibi transfekte edin. Her numuneden hücreleri ayrı 15 mililitrelik steril tüplerde tripsinizasyon ile hasat edin. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 751 g'da santrifüjleme ile 1X PBS ile iki kez yıkayın ve ardından süpernatanı çıkarın. Pipetleme yoluyla 200 mikrolitre buz gibi soğuk 1X PBS ekleyerek peleti yeniden askıya alın ve kırın.

Hücreleri sabitlemek için tüpü hafifçe girdaplarken tüpe damla damla 2 mililitre %70 buz gibi etanol ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 1 saat boyunca 4 santigrat dereceye koyun. Tüpleri 4 santigrat dereceden çıkarın ve santrifüjleyin.

2 mL buz gibi soğuk PBS ve girdap ekleyin ve ardından süpernatanı santrifüjleme ile çıkarın. Her numuneye mililitre başına sırasıyla 50 ve 200 mikrogram konsantrasyonlarda propidyum iyodür ve ribonükleaz A içeren 500 mikrolitre 1X PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Numuneleri ışıktan koruyarak uygun tüplere aktarın ve akış sitometresinde çalıştırın.

08:52

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:44

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:02

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:19

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:38

RNA Ekstraksiyon Testi: miRNA Transfekte Edilmiş Akciğer Kanseri Hücrelerinden RNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:02

Antikor mikrodizisi: miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin protein ekspresyonunu incelemek için bir teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

16:24

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:01

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:00

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:44

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026