JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:02 dk • April 30th, 2023
- Protein örneğine bir biyotin çözeltisi ve bir etiketleme tamponu ekleyerek başlayın. Biyotinin proteinlere bağlanmasını kolaylaştırmak için inkübe edin. Bir durdurma reaktifi ve girdap ekleyin. Daha sonra, antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bir bloke edici reaktif içeren bir tabağa bir antikor mikrodizi slaydı yerleştirin. Engelleme solüsyonunu çıkarmak için slaytı çift damıtılmış suyla yıkayın. Mikrodizi slaytını bir hazneye yerleştirin. Biyotinile protein örneğini bir birleştirme çözeltisi ile karıştırın ve hedef proteinlerin karşılık gelen antikorlarına bağlanmasını kolaylaştırmak için lam üzerine ekleyin. Sürgüyü yıkama tamponu içeren bir tabağa aktarın ve tamponu çift damıtılmış su ile değiştirin. Daha sonra, slaytı, biyotinile proteinlere bağlanmasını desteklemek için floresan etiketli streptavidin içeren bir algılama tamponuna yerleştirin.
Floresan yoğunluğunu korumak için çanağı karanlıkta inkübe edin. Slaytı çıkarın ve bir mikrodizi tarayıcıya yerleştirin. Tarayıcı, hedef proteine bağlı streptavidinden gelen floresan sinyalleri arar. Floresan yoğunluğuna bağlı olarak, yazılım protein ekspresyonunun derecesini analiz eder. Aşağıdaki protokolde, hücre döngüsü ile ilişkili gen ekspresyonundaki değişiklikleri analiz etmek için bir antikor mikrodizisi gerçekleştiriyoruz.
- Bu deney, mikroRNA tedavisi ile tüm hücre döngüsü yolu proteinlerinin ekspresyon değişikliğini tanımlamak içindir. Transfeksiyon bölümünde açıklanan prosedüre göre protein örneklerini toplayın ve BCA testi ile nicelleştirin. Oda sıcaklığına getirmek ve nemi gidermek için slaytları deneyden bir saat önce eksi 4 santigrat dereceden çıkarın. 70 mikrogram protein numunesi alın ve metin bölümünde adım adım açıklanan üreticinin talimatlarına göre numune slaytları hazırlayın.
Burada dikkat edilmesi gereken, slaytların ultra saf deiyonize su ile uygun şekilde yıkanması, slaytların arka planını azaltmaya yardımcı olacağı için bir diğer önemli adımdır. Ek olarak, bu deneyde numune slaytlarının son adıma kadar kurutulmaması çok önemlidir. Son olarak, mikroarray makinesini kullanarak slaydı tarayın ve verileri analiz edin.
Bu makale, mikroRNA uygulaması sonrası hücre döngüsü ile ilişkili protein ekspresyon değişikliklerini analiz etmek için bir antikor mikrodizisi gerçekleştirme protokolünü detaylandırmaktadır. Yöntem; proteinlerin biyotinillenmesini, mikrodizi lamı üzerindeki antikorlara bağlanmalarını ve protein ekspresyonunu nicelendirmek için floresan sinyallerin saptanmasını içermektedir.
Antikor mikro-dizi platformları, miRNA ilele tedavi edilmiş akciğer kanseri hücrelerindeki protein ekspresyon değişikliklerinin çoklu kuantifikasyonuna olanak tanıyarak erken keşfi ve mekanizmik risk azaltmayı destekler. Bu yaklaşım, hücre döngüsü ve anjiyogenez yolu modülasyonu hakkında uygulanabilir veriler sağlayarak hedef doğrulaması ve portföy önceliklendirmesine bilgi sunar. Kantitatif protein profillemenin entegrasyonu, kritik keşif dönüm noktalarında öngörü güvenini artırır.
Bu antikor mikro-dizi iş akışı, miRNA tedavisi sonrası yüksek içerikli protein profillemesine olanak tanıyarak erken keşif, hedef doğrulama ve preklinik araştırmalar arasında köprü kurar.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026