JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:48 dk. • April 30th, 2023
- Ötenazi yapılmış bir fare alarak başlayın ve laboratuvar bandı ile bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Cildi kesmek için makas kullanın. Diyaframdan dikey bir kesi yapın ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkaran göğüs boşluğuna ulaşmak için kaburgaları kesin. Sonra, kalbin sol ventrikülünde küçük bir kesi yapın. Daha sonra, sağ ventrikülü bulun ve ventrikülün lümenine PBS içeren bir şırınga yerleştirin. PBS'yi sağ ventrikülden geçirin, akciğerler beyazlaşana kadar kanın sol ventriküldeki önceden yapılmış kesikten dışarı akmasına izin verin. Tümör nodülleri içeren akciğer dokusunu çıkarın ve küçük parçalar halinde kıyın.
Parçaları akciğer sindirim tamponunda inkübe edin. Akciğer sindirim tamponundaki kollajenaz, hücreleri izole etmeye yardımcı olur ve DNAse, ölü hücrelerden DNA'yı ortadan kaldırmaya yardımcı olur. Topakları çıkarmak ve hücre süspansiyonunu homojen hale getirmek için elde edilen süspansiyonu bir hücre süzgecinden süzün. Artık eritrositleri parçalamak için peleti amonyum klorür potasyum tamponunda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. Peletteki WBC'leri ve tümör hücrelerini toplamak için santrifüjleyin. Hücre stabilitesini korumak için FCS ile takviye edilmiş PBS'de peleti yeniden süspanse edin. Aşağıdaki protokolde, akış sitometrik analizi için akciğer hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını göstereceğiz.
Uygun deney son noktasından sonra, karkası% 70 etanole batırın ve hayvanı bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Ventral orta hat insizyonu yapın ve göğüs duvarı kaslarını ve karın organlarını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe ters çevirin. Diyaframı delmek ve göğüs boşluğunu açığa çıkaran kaburgaları kesmek için makas kullanın. Sol ventrikülde küçük bir açıklık kesin ve infüzyon başına 6 ila 8 mililitre buz gibi soğuk PBS ile akciğeri sağ ventrikülden üç kez perfüze etmek için 27 gauge iğne kullanın. Son perfüzyondan sonra, akciğerler tamamen kandan arındırılmalı ve beyaz görünmelidir. Hasattan sonra, akciğer dokusunu küçük parçalar halinde doğramak için makas kullanın.
Akciğer parçalarını, çalkalama ile 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakikalık bir inkübasyon için 1.5 mililitre akciğer sindirim tamponu içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sindirimin sonunda, hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan doku parçalarını filtreden geçirmek için steril 10 mililitrelik bir şırınga pistonunun ucunu kullanın. Süzgeci% 2 FCS ile takviye edilmiş 15 mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Pelet, oda sıcaklığında 5 dakikalık bir inkübasyon için 1 mililitre amonyum klorür potasyum lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Daha sonra beyaz kan hücresi peletini% 2 FCS ile desteklenmiş 1 mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve deney protokolüne göre akış sitometrik analizi için hücreleri boyayın.