Plazma miRNA izolasyonu için santrifüj sıcaklığı neden önemlidir?

4 °C'de santrifüjleme, hücre lizini ve kan hücrelerinden spesifik olmayan miRNA salınımını önleyerek biyobelirteç analizi için örnek bütünlüğünü korur.

Proteinaz K, ekstraksiyon sırasında miRNA'yı nasıl korur?

Proteinaz K, sonraki işlem aşamaları sırasında RNA'yı sindirebilecek nükleazlar dahil olmak üzere proteinleri parçalayarak miRNA stabilitesini sağlar.

Protokolde DNase 1 işleminin amacı nedir?

DNase 1, örnekteki genomik DNA kontaminasyonunu gidererek sonraki uygulamalar için miRNA saflaştırmasının özgüllüğünü artırır.

Plazma, toplandıktan sonra neden bir saat içinde işlenmelidir?

Zamanında işlem yapılması, ex vivo hücresel değişiklikleri ve miRNA salınımını veya bozunmasını önleyerek, dolaşan biyobelirteç profilinin sadakatini korur.

Ekstrake edilen miRNA bütünlüğünü hangi saklama koşulu korur?

Elüye edilen miRNA'nın -80 °C'de saklanması, RNA degradasyonunu önler ve boylamsal biyobelirteç çalışmaları için uygunluğu sağlar.

miRNA Ekstraksiyonu: Plazma Örneğinden miRNA'yı Çıkarmak İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 3:59 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- MikroRNA'lar veya miRNA'lar, gen regülasyonunda yer alan küçük, kodlamayan RNA'lardır. İfadeleri kanser sırasında değişir ve bu nedenle potansiyel kanser biyobelirteçleridir. MiRNA izolasyonuna başlamak için, taze toplanmış tam kan örneğini alın ve plazmayı kan hücrelerinden ayırmak için 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve daha net bir plazma süpernatanı elde etmek için tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı ekstrakte edin, soğutulmuş homojenizasyon solüsyonu ile muamele edin, ardından numuneyi homojenize etmek için lizis tamponu uygulayın. Proteinleri, özellikle de aşağı akış adımları sırasında RNA'yı sindirecek olan nükleazları parçalamak için proteinaz K enzim çözeltisi ekleyin.

- Daha sonra, lizatı önceden monte edilmiş bir alete özel nükleik asit çıkarıcı kartuşun belirlenmiş kuyucuğuna yükleyin. Numuneden genomik DNA'yı ortadan kaldırmak için uygun kuyucuğa DNaz 1 solüsyonu ekleyin. MiRNA izolasyonundan önce şartlandırma için kartuş üzerine monte edilmiş elüsyon tüpüne nükleaz içermeyen su ekleyin. Kartuş tertibatını nükleik asit çıkarıcıya yükleyin. Uygun miRNA saflaştırma yazılımını seçin ve çalıştırın. Tamamlandığında, miRNA içeren elüsyon tüpünü çıkarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

- Aşağıdaki protokolde, akciğer kanseri taraması için hasta kan örneklerinden miRNA ekstraksiyonunu gösteriyoruz.

- Bu protokolü başlatmak için, 10 mililitre tam kan örneği toplamak için vakum tüpleri kullanın. Oda sıcaklığında saklayın.

- Spesifik olmayan bir mikroRNA salınımına yol açan termal şok ve hücre parçalanmasını önlemek için tam kanı 4 santigrat derece gibi düşük bir sıcaklıkta saklamayın.

- Plazmayı ayırmak için bir saat içinde santrifüjleyin. Lenfositik halka ile temastan kaçındığınızdan emin olurken, süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra süpernatanı aynı koşullarda santrifüjleyin. Bu plazma süpernatanının 1 mililitresini 1.5 milimetre kriyoviyallere ayırın, plazma fraksiyonunu tüp tabanından toplamamaya dikkat edin. RNA izolasyonunu başlatmak için, her numune için 200 mikrolitre plazmaya 200 mikrolitre önceden soğutulmuş OMG çözeltisi ekleyin. Tam homojenizasyonu sağlamak için 15 ila 30 saniye vorteks yapın. Numuneyi homojenize etmek için, numune başına 200 mikrolitre lizis tamponu ve 25 mikrolitre proteinaz K ekleyin ve 20 saniye boyunca vorteksleyin.

- Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede bir termomikserde 15 dakika inkübe edin. Ardından, RSC miRNA doku yöntemini seçin ve pistonu düzgün bir şekilde yerleştirerek otomatik bir nükleik asit çıkarıcısının güverte tepsisine her numune için bir kartuş yükleyin. Lizatı aktarın ve 5 mikrolitre DNase 1 solüsyonunu alet kartuşundaki uygun konumlarına ekleyin. Her bir elüsyon tüpünün tabanına 60 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Otomatik arıtmaya başlamak için çalıştırmayı başlatın. Toplam RNA örneklerini eksi 80 santigrat derecede saklayın.