$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Nazik antijen alımına izin vermek için bir amonyak çözeltisine ince bir doku bölümü yerleştirerek başlayın. Kesiti polilisin kaplı bir slayta aktarın. Negatif yüklü hücreler, pozitif yüklü polilisine bağlanır. Ardından, endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için hidrojen peroksit ekleyin. Slaytı Tris-Buffered Salin, TBS ile yıkayın.
TBS, protein çapraz bağlarını kırarak antikorların antijenlere erişimini teşvik eder. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için bölümü bir blok solüsyonla yıkayın. Bölüme birincil antikorlar ekleyin ve gece boyunca inkübe edin. Birincil antikor, hücre yüzeyinde bulunan spesifik antijenine bağlanır. Slaytı TBS ile yıkayın.
Primer antikorun Fc bölgesine bağlanan Biotin konjuge sekonder antikorları ekleyin. Bölümü streptavidin-biotin peroksidaz enzimi ile yıkayın. Daha sonra, dokuya peroksidazın kromojenik substratını ekleyin. Peroksidaz, kromojeni renkli çözünmeyen bir ürüne dönüştürür.
Dokuyu hematoksilen çözeltisi ile lekeleyin. Hematoksilin, hücrelerin asidik bileşenlerine bağlanır ve onları maviye çevirir. Dokuyu ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Antijenler kırmızı olarak tespit edilirken, hücreler hematoksilen nedeniyle mavi görünür. Aşağıdaki protokolde, endobronşiyal biyopsilerden CD45 ve CD1a hücrelerini tanımlamak için immünohistokimyasal boyama yapacağız.
- Gömülü biyopsi dokusunu bölümlere ayırmadan önce, bıçak tutucuyu biyopsi bloğunun açısına göre dikkatlice ayarlayın, böylece bıçak bloğun yüzeyine düz bir şekilde dayanır. Daha sonra, her bir endobronşiyal biyopsi örneğinden en az iki adet 2 mikron kalınlığında kesit kesin, her taze kesilmiş doku dilimini %0.05'lik bir amonyak ve damıtılmış su çözeltisine aktarmak için forseps kullanın. 45 ila 90 saniye sonra, katlanmamış her bir bölümü almak için poli-l-lizin kaplı bir mikroskop lamı kullanın ve bölümlerin en az bir saat kurumasını bekleyin.
Bölümler kuruduğunda, slaytları deney için uygun şekilde etiketleyin ve her numunenin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Daha sonra, bölümlere 1 mililitre taze hazırlanmış peroksidaz blok çözeltisi uygulayın. 30 dakika sonra, peroksidaz blok çözeltisini çıkarın ve daha sonra bölümleri TBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın, daha sonra TBS'yi çıkarın ve herhangi bir spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke etmek için 30 dakikalık bir inkübasyon için% 1'lik bir BSA bloke etme çözeltisi ekleyin.
İnkübasyonun sonunda, TBS'de seyreltilmiş ilgilenilen birincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir gece inkübasyon için numuneleri örtün. Ertesi sabah, slaytları TBS'de üç kez yıkayın ve ikincil antikoru oda sıcaklığında iki saat boyunca uygulayın. İnkübasyonun sonunda, slaytları taze TBS'de üç kez daha yıkayın ve numuneleri taze hazırlanmış streptavidin-biotin peroksidaz kompleks çözeltisi içinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve ardından üç TBS yıkaması daha yapın.
Daha sonra bulaşıklara taze hazırlanmış AEC peroksidaz substrat çözeltisi ile 20 ila 30 dakika muamele edin. İstenilen leke yoğunluğu geliştiğinde, slaytları akan musluk suyunda beş dakika durulayın ve bölümleri filtrelenmiş Mayer'in hematoksilen solüsyonu ile boyayın. İki dakika sonra, slaytları akan musluk suyunda beş dakika daha yıkayın, ardından slaytları boşaltın ve bölümleri kalıcı sulu montaj ortamı ile kaplayın, numuneleri 80 derecelik bir kurutma fırınında kurutun.
Soğuduktan sonra, numuneleri bir ışık mikroskobu üzerinde 40 kat büyütmede analizleri için DPX montaj ortamı ve bir kapak fişi ile monte edin.