JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 5:08 dk. • April 30th, 2023
- Fotodinamik terapi veya PDT, belirli dalga boylarındaki ışıklar tarafından aktive edilen moleküller olan ışığa duyarlılaştırıcıları kullanan bir tür ışık terapisidir. Uyarılmış bir ışığa duyarlılaştırıcı, hücrelerde bulunan moleküler oksijeni, hücre ölümüne neden olan reaktif oksijen türlerine dönüştürür. Tahlillere başlamak için, tek başına veya bir test ilacı ile kombinasyon halinde, ışığa duyarlılaştırıcının uygun konsantrasyonunu taşıyan istenen bir nanopartikül bazlı ilaç dağıtım sistemi hazırlayın.
Bu nanopartikül süspansiyonunun tercih edilen konsantrasyonunu bir akciğer kanseri hücresi kültürüne ekleyin. Nanopartiküllerin hücresel alımını kolaylaştırmak için kültürü karanlıkta uygun bir süre inkübe edin. Süspansiyonu istenen kültür ortamıyla değiştirin. Daha sonra, bir fotodinamik terapi fiber lazerini kültürün üzerine, düzgün aydınlatmayı kolaylaştıran en uygun mesafede yerleştirin. Hücreleri istenen süre için uygun bir dalga boyunda ışınlayın ve gece boyunca inkübe edin.
Ortamı uygun bir sitotoksisite ölçüm solüsyonu ile değiştirin. Hücre canlılığını ölçmek ve deneysel tedavinin sitotoksik etkilerini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Işığa duyarlılaştırıcı içeren ışınlanmış hücreler canlılığın azaldığını gösterir. Aşağıdaki protokolde, A549 akciğer kanseri hücrelerinde hyaluronik asit-seramid nanopartikülleri içinde kapsüllenmiş bir ışığa duyarlılaştırıcı olan hipokrellin B ve bir antikanser ilacı olan paklitakselin in vitro fototoksisite analizini gerçekleştireceğiz.
- Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hyaluronik asit-seramidi sentezleyin. Ürünü 3,5 kilodaltonluk bir diyaliz membranı kullanarak saflaştırın ve liyofilize edin.
Daha sonra, hyaluronik asit-seramid nanopartiküllerini kendi başlarına, ışığa duyarlılaştırıcı ile birlikte hyaluronik asit-seramid nanopartiküllerini ve bir antikanser ajanı ve ışığa duyarlılaştırıcı ile hyaluronik asit-seramid nanopartiküllerini hazırlayın.
Akciğer kanseri hücre hattı A549'u, oyuk başına 1 kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına tohumlayın ve hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra hazırlanan nanopartikülleri PBS'de, ışığa duyarlılaştırıcı, hipokrellin B'nin mililitresi başına 2 mikromollük bir nihai konsantrasyona girdap yaparak çözün.
Her biri dört oyuğa 1 mililitre PBS, 1 mililitre boş hyaluronik asit-seramid nanopartikülleri, 1 mililitre ışığa duyarlılaştırıcı içeren nanopartiküller ve hem ışığa duyarlılaştırıcı hem de antikanser ilacı içeren 1 mililitre nanopartikül ekleyin.
Bittiğinde, plakayı örtün ve nanopartiküllerin hücrelere girmesine izin vermek için karanlıkta dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tüm solüsyonları çıkarın ve 1 mililitre soğuk PBS ekleyerek hücreleri yıkayın.
Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve ardından taze kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, 24 oyuklu kültür plakasını bir fotodinamik terapi lifinin altına yerleştirin ve lifi ilk oyuktan 1 santimetre uzağa yerleştirin.
- Fotodinamik terapi lifinden hücrelere olan mesafe bu çalışmada kritik faktördü. Işıkla tüm hücreyi kaplayabilecek en uygun mesafeyi bulmak önemliydi.
- Ardından koruyucu gözlükleri takın ve ışıkları söndürün. Işığa duyarlılaştırıcı içeren nanopartiküllerdeki yüksek oranda reaktif singlet oksijeni ve diğer serbest radikalleri aktive etmek için hücreleri karanlıkta 5 ila 40 saniye arasında
aydınlatın.Işığa maruz kaldıktan sonra, hücreleri karanlıkta 24 saat inkübe edin. Daha sonra, kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 1 mililitre soğuk PBS ile yıkayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve ardından her oyuğa 100 mikrolitre ortam ve 10 mikrolitre sitotoksisite ölçüm solüsyonu ekleyin.
Çözeltideki hücreleri karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin ve ardından tüm örnekleri 96 oyuklu bir plakaya taşıyın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nanometrede ölçün.