Eksozom İzolasyonu: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hastalarının Plazmasından Eksozomları Ayırmak İçin Bir Teknik

- Eksozomlar, lipitler, proteinler, DNA, mRNA ve mikroRNA gibi biyomolekülleri taşıyan küçük, zara bağlı veziküllerdir. Eksozomlar, farklı hücre tipleri tarafından hücre dışı boşluklara salınır ve plazma gibi biyosıvılardan izole edilebilir.

Başlamak için, hücreleri ve kalıntıları temizlemek için plazma örneğini santrifüjleyin. Plazma süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Plazmayı istenen konsantrasyonda ribonükleaz enzimi ile tedavi edin. Numuneyi uygun bir süre boyunca 37 santigrat derecede bir ısıtma bloğu üzerinde inkübe edin.

Enzim, numunedeki herhangi bir serbest RNA'yı bozarken, ekzozomal RNA korunmaya devam eder. Numuneyi PBS kullanarak seyreltin. Daha sonra, istenen konsantrasyonda Proteinaz K enzim çözeltisini ekleyin ve uygun bir süre boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Proteinaz K, plazma proteinlerinin büyük kısmını bozar. Aynı zamanda daha önce eklenen ribonükleaz enzimini inaktive eder, böylece sonraki işleme sırasında ekzozomal RNA bozulması riskini ortadan kaldırır.

Plazmadan eksozom ayrılmasını kolaylaştırmak için uygun hacimde eksozom çökeltme tamponu ekleyin. Bozulmamış eksozomlar içeren bir pelet elde etmek için numuneyi santrifüjleyin. İzole edilen eksozomlar, RNA ve protein ekstraksiyonları gibi aşağı akış adımlarında uygulamalar bulur.

Aşağıdaki protokolde küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarının plazma örneğinden eksozom izolasyonu yapacağız.

- Başlamak için, 1 mililitrelik bir plazma örneğini buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, oluşmuş olabilecek kriyopresipitatları ayrıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Daha sonra, hücreleri ve kalıntıları gidermek için plazmayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2.000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve plazmayı tekrar santrifüjleyin, şimdi 20 dakika boyunca 10.000 Gs'de. Yine, plazma süpernatantını toplayın ve şimdi 10 mikrolitre RNAse ekleyin. Plazmayı bir termal blok ısıtıcısında 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

- Serbest mikroRNA'ları parçalamak için standart kit protokolüne bir RNAse tedavi basamağı ekledik. Daha sonra, RNAse'ı parçalamak ve ekzozomal mikroRNA'ların bütünlüğünü korumak için kit protokolüne dahil edilen proteinaz K tedavi adımından yararlanıldı.

- Daha sonra, plazmayı 1x PBS'nin yarım hacminde yeni bir tüpe aktarın ve girdaplayın. Daha sonra, 0.05 hacim proteinaz K çözeltisi ekleyin, numuneyi tekrar vorteksleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Şimdi, 0.2 hacim eksozom çökeltme tamponu ekleyin ve numuneyi ters çevirerek karıştırın. Ardından, numuneyi 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Soğuk inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatantın 20 ila 50 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve kontrol amacıyla saklayın. Sonra kalan süpernatanı aspire edin ve atın.

Eksozom peletini, aşağı akış analizine bağlı olarak bir hacimde, tercih edilen tamponda yeniden süspanse edin. RNA analizi için, RNA ekstraksiyonu için spesifik lizis tamponu ekleyin.