JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:17 dk. • April 30th, 2023
- İlk olarak, ozmolariteyi dengeleyerek hücre büzülmesini veya şişmesini önlemek için PBS ile ıslatılmış bir filtre kağıdına bir doku dilimi yerleştirin. Dokuyu bir histo kasete aktarın. Kaseti kapatın ve nötr tamponlu formalin, NBF çözeltisine yerleştirin. NBF, amino asitlerin amino gruplarına bağlanan ve dokuyu pigmentleyen formik asit oluşumunu önleyen formaldehit içerir. Kaseti gece boyunca düşük bir sıcaklıkta bırakın, bu da nükleik asit bozulmasını önler ve dokuyu sabitler. Dokuyu birden fazla alkol yıkaması ile kurutun.
Sıvı parafine yerleştirin ve kalıbın dibine kadar bastırın. Ağırlığı çıkarın ve histo kasetinin alt kısmını dokunun üzerine yerleştirin. Düzeneğin üzerine sıvı parafin dökün. Kurulumun soğuk bir plaka üzerinde katılaşmasına izin verin. Parafin suda çözünmez ve susuz dokuya girdikten sonra sertleşir ve bölünmeye yardımcı olur. Doku bloğunu bir mikrotom üzerine aktarın. Dokunun ince bölümlerini bir slayt üzerinde kesin ve toplayın. Kesit çok kalınsa, oksijen ve diğer besinler dilim boyunca yayılamaz ve yanlış bir nekroz gradyanı oluşturur. Bölüm çok inceyse, kıvrılma eğilimindedir. Protokol videosu, akciğer kanserinin FFPE dokularından biyobelirteç ekspresyonunu ve hücre canlılığını inceler.
- İstenilen dilimi sabitlemeye başlamak için, forseps kullanarak 2 ila 3 mililitre PBS ile doldurulmuş ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren 10 santimetrelik bir plakaya dikkatlice aktarın ve yüzmesine izin verin. Ardından filtre kağıdını bir çift forseps ile kaldırın ve bir histo kasete yerleştirin. Filtre kağıdını bir histo kasete aktarın. Sonraki adımlar için dilimin konumunu işaretlemek için doku diliminin üzerine bir damla seyreltilmiş hematoksilen ekleyin. Kaseti kapatın ve% 4 nötr tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede bırakın. Kaseti protokolde anlatıldığı gibi yıkadıktan ve işledikten sonra, histo kasetini açın ve sabit dilimi filtre kağıdından dikkatlice kaldırmak için bir neşter kullanın. Filtre kağıdını atın ve dilimi sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.
Eşit kesit almayı sağlamak için dokuyu gömme kalıbının altına bastırmak için düz bir ağırlık kullanın. Histo kasetinin alt kısmını kalıbın üzerine yerleştirin, üzerine sıvı parafin ekleyin ve kalıbı soğuk bir tabakta 30 dakika soğumaya bırakın. Bundan sonra, soğutulmuş kalıbı parafin bloğundan ayırın. FFPE doku dilim bloklarının 4 mikrometre inceliğinde kesitlerini hazırlamak için bir mikrotom kullanın. Dokuyu çevreleyen parafin fazlalığını kesin. Doku boyunca eşit bölümler elde etmek için, bloğun açısını, bloğun yüzeyi bıçağa göre yatay olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın. İnce bir fırça kullanarak, cam slaytların üst kısmından başlayarak parafine gömülü doku diliminin sıralı doku bölümlerini toplayın. Daha derin doku katmanlarının bölümlerini ortaya doğru toplamaya devam edin, ardından cam slaytların alt kısmı takip edin.
- Her doku diliminin farklı katmanlarından nesne slaytlarına kesitlerin toplanması, canlılık, hücre göçü veya biyobelirteç ekspresyonunda potansiyel kültür kaynaklı gradyanların yakalanmasını sağlamak için yapılır.
- Bölümleri topladıktan sonra, protokolde açıklandığı gibi işlemeye ve daha fazla analize devam edin.