DNA Kararlı-İzotop (DNA-SIP) Probing

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvar yetiştiriciliği ön koşulu olmaksızın ilgilenilen bir büyüme substratını tüketen aktif mikroorganizmalardan DNA elde etmektir. Bu, ilk olarak, doğal ortamda bulunanlara benzer koşullar altında, ilgilenilen stabil bir izotop etiketli substrat ile bir çevresel numunenin inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu izotop etiketli numuneden toplam DNA'yı çıkarmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, bu DNA'yı sezyum klorür içinde yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjlemeye tabi tutmaktır. Prosedürün son adımı, sonraki moleküler karakterizasyon için ağır ve hafif DNA elde etmek için yoğunluk gradyanını fraksiyonlamaktır. Sonuç olarak, parmak izi, mikrodizi, hibridizasyon, klonlama, kütüphane analizi ve metagenomik dahil olmak üzere çeşitli olası moleküler teknikler yoluyla belirli bir substratın metabolizmasında yer alan aktif ancak kültürlenmemiş mikroorganizmaların kimliğini ortaya çıkaran sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Waterloo Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Josh Neufeld. Ben Eric Dunford, Newfeld Laboratuvarı'nda yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün size, bilinmeyen ve potansiyel olarak ekilmemiş mikroorganizmaların kimliğini ilgilenilen bir büyüme substratını kullanma yetenekleriyle ilişkilendirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelen DNAS izotop sondalaması veya DNA yudumu için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü Newfeld laboratuvarında, çeşitli karasal ve sucul ortamlardaki karbon kaynaklarının metabolizmasını incelemek için kullanıyoruz. Bugün size belirli bir karbon substrat olan 13 C glikozun bir toprak örneğine uygulanmasını göstereceğiz. Ancak, bu yöntemin ilk olarak Warwick Üniversitesi'ndeki Colin Merle'nin Grubu tarafından geliştirilmesinden bu yana, araştırmacıların protokolü çeşitli farklı ortamlara uygulanacak şekilde çeşitlendirdiklerini ve ayrıca nitrojen ve oksijen gibi çeşitli farklı etiketli izotoplar kullandıklarını kabul ediyoruz.

Bugün karbona odaklanacağız, ancak protokolün kendisi farklı deneysel tasarımlara uygulanabilir. Öyleyse başlayalım. Bu prosedürün başlamasından önce, bu protokolün yazılı bölümünde açıklandığı gibi tüm DNA kararlı izotop sondalamasını veya DNA CYP reaktiflerini hazırlayın.

DNAC, numune inkübasyonu ile başlar. İnkübasyon koşulları, çeşitli numune ve substrat özelliklerine bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Uygun inkübasyon koşulları ampirik olarak belirlendikten sonra, uygun substrat değişikliğini çevresel numuneye ekleyin.

Ayrıca, test inkübasyonlarına dayalı olarak gerekliyse, mikrobiyal büyümeyi sağlamak için ek besinleri dahil etmeyi de seçebilirsiniz. Numune inkübasyonu kurulduktan sonra, numuneyi kapatın ve kapatın, ardından etiketli substrat içeren çevresel numuneleri inkübe edin. Gösterilen örnek, bir toprak örneğine karbon 13 etiketli bir glikoz çözeltisinin eklenmesini içerir.

Ardından, sonraki adımlarda gözlemlenen nükleik asidin belirgin etiketlemesini doğrulamak için bir karşılaştırma görevi görecek bir kontrol inkübasyonu ayarlayın. Bu numuneyi, substrat kapağı olarak etiketlenmemiş karbon kullanmak dışında aynı koşullar altında hazırlayın, çevresel numuneyi, inkübasyon ekstraktını, mikrokozmostan elde edilen DNA'yı takiben aynı koşullar altında etiketlenmemiş substrat ile kapatın ve inkübe edin. Daha sonra, aous jel ve bir spektrofotometre kullanarak aşağıdaki ultrasantrifüjleme adımları için ekstrakte edilen DNA'yı ölçün.

Hafif ve ağır DNA'nın mümkün olan en yüksek şekilde ayrılmasını sağlamak için ultrasantrifüjleme için dikey veya dikeye yakın rotorlar kullanın. Beckman Coulter VTI 65.2 rotoru, ultrasantrifüjleme için numune hazırlamak üzere 5.1 mililitre hızlı sızdırmaz polimer tüpleri tutmak için 16 kuyuya sahiptir. İlk olarak, ultrasantrifüj tüplerine 0,5 ila beş mikrogram DNA eklemek için gereken ekstrakte edilmiş DNA hacmini hesaplayın.

Önceden belirlenmiş DNA konsantrasyonlarını kullanarak. Ardından, bir dijital refraktometre kullanarak sezyum klorür stok çözeltisinin tam yoğunluğunu belirleyin. Yazılı protokolde önerildiği gibi, uygun bir karışım oranı oluşturmak için gereken gradyan tampon DNA çözeltisinin hacmini hesaplayın.

Bu hesaplamaları kullanarak, ekstrakte edilen DNA'yı gradyan tamponu ve 4.8 mililitre sezyum klorür ile steril tek kullanımlık 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Ortaya çıkan hacim, tüpleri tamamen doldurmak için santrifüj tüplerinin belirtilen kapasitesinden daha büyük olacaktır. Son olarak tüpü bu protokolün varyasyonlarını 10 kez ters çevirerek çözümü yapar.

DNA'nın tüp içinde görüntülenmesini sağlamak için gradyan çözeltisi içinde ahy ve bromür gibi bir flora kuvveti kullanın. Burada gösterildiği gibi bir AUM bromür gradyanı da dahil olmak üzere saf kültür DNA'sı ile hazırlandığında DNA yoğunluğunun değiştirilmesi, her santrifüjden sonra gradyan oluşumunun anında görsel olarak doğrulanmasını sağlamak için özellikle yararlıdır. Böyle bir yaklaşımı kullanmak için çalıştırma adımları yazılı protokolde açıklanmıştır.

Önce ultrasantrifüjlemeyi kurmak için, bir ampul kullanın ve ultrasantrifüj tüplerini gradyan çözeltileriyle dikkatlice doldurmak için bir pipet geçirin. Tüp omzundaki tüpleri ince bir kalıcı işaretleyici ile etiketleyin. Tüplerin tam olarak tüp boynunun tabanına kadar doldurulduğundan emin olun, çünkü yetersiz doldurulmuş tüpler ultrasantrifüjleme sırasında patlama eğilimi gösterir.

Gerekli tüm tüpler numune çözeltileriyle doldurulduktan sonra, her bir tüpün kesin kütlesini kaydedin, tüpleri birbirine yakın eşleşen çiftler olarak sıralayın ve 10 miligram içinde dengelenene kadar yeni çözelti miktarlarımı ekleyin veya çıkarın. Çözelti seviyesini mümkün olduğunca tüpün tabanına yakın tutun. Ardından, üreticinin talimatlarına göre bir tüp kabı kullanarak tüpleri kapatın.

Tüpleri ters çevirerek ve orta derecede basınç uygulayarak düzgün bir şekilde kapatıldığını kontrol edin. Ultrasantrifüjlemeden önce sızdırmaz hale getirildikten sonra hala dengeli olup olmadıklarını kontrol etmek için tüpleri tekrar tartın. Temiz olduklarından ve ultrasantrifüjleme sırasında tüpleri delebilecek herhangi bir toz ve kalıntı içermediklerinden emin olmak için her rotoru dikkatlice inceleyin.

Tüpleri rotora yerleştirin ve dengeli çiftleri birbirine zıt hale getirin. Ultrasantrifüjleme işlemi işaretleyici etiketlerini okunaklı hale getirebildiğinden, her numunenin rotor konumunu kaydedin. Rotor kuyularını üretici tarafından belirtildiği gibi dikkatlice kapatın.

Rotor kuyuları kapatıldıktan sonra, rotoru ultrasantrifüje yükleyin. Ultrasantrifüj kapağını kapatın ve VTI 65.2 rotoru için bir vakum uygulayın. Dönme hızını 44, 100 RPM, sıcaklığı 20 santigrat derece ve ultrasantrifüj süresini 36 ila 40 saate ayarlayın.

Vakumun açık olduğundan emin olun, maksimum hızlanmayı seçin ve eğimin yavaşlama nedeniyle bozulmamasını sağlamak için freni kapatın. Ultrasantrifüjlemeden hemen sonra rotoru dikkatlice çıkarın. Borulardaki eğimleri bozmamak için rotoru eğmemeye veya çarpmamaya dikkat edin.

Son olarak, gradyan fraksiyonlaması için tüpleri yavaşça çıkarın. DNA, fraksiyonlama tekniği kullanılarak ultrasantrifüj tüplerinden ekstrakte edilebilir. Başlamak için, steril 60 mililitrelik bir şırıngayı yeterli propofol mavi boya içeren steril, damıtılmış ve deiyonize su ile doldurun.

Koyu mavi bir renk sağlamak için, şırıngayı şırınga pompasının yükleme koluna yerleştirin. Ardından, 23 gauge bir inçlik bir iğne ile donatılmış pompa hortumunu takın ve iğnenin ucundan bir miktar su gelene kadar pompayı açın. Fraksiyonlama işlemini olumsuz etkileyeceği için su kaynağında herhangi bir hava kabarcığı oluşmasını önleyin.

Her numune için, numune numarasını ve fraksiyonunu gösteren etiketlerle 12 adet steril 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Ardından, ultrasantrifüj tüplerinden birini hızlı ve kontrollü bir hareketle bir kelepçe standına sabitleyin. Yeni 23 gauge bir inçlik iğne kullanarak tüpün altını tüp dikişi boyunca delin ve düzgün bir delik oluştuğundan emin olmak için iğneyi döndürün.

Lateks eldivenlerin iğne mili üzerinde nitril eldivenlere göre daha iyi kavrama sağladığını görebilirsiniz. Pompa borusuna bağlı olan iğneyi kullanarak, borunun üst boru omzunun üst kısmını dikiş boyunca hızlı ve kontrollü bir şekilde delin. Tüpün üst kısmının delinmesinin ardından tüpün alt kısmının da delinebileceğini unutmayın.

Ayrıca, tüpün omzunu kaplayan az miktarda mineral yağın, önceden kalibre edilmiş bir pompa hızı ile üst iğnenin etrafındaki uygun olmayan bir contadan sızıntıyı önlemeye yardımcı olabileceğini unutmayın. 12 dakikada 12 425 mikrolitrelik fraksiyon elde etmek için boyalı suyu tüpün üstüne pompalayın. Gradyan çözeltisini etiketli mikro santrifüj tüplerinde toplamak için bir zamanlayıcı kullanın.

Son olarak, en az bir numune veya kontrol gradyanı için tüm fraksiyonların yoğunluğunu kontrol edin. Dijital refraktometre kullanma. Tüm fraksiyonlardan DNA'yı çökeltmek için mililitre başına yaklaşık 1.690 gram medyan yoğunluğa sahip mililitre başına 1.760 ila 1.725 gram aralığında değerler bekleyin.

İlk olarak, çökeltme için bir taşıyıcı olarak 20 mikrogram doğrusal poli akrilamid ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Daha sonra iki hacim PEG çözeltisi ekleyin ve tekrar ters çevirerek karıştırın. İnkübasyondan sonra DNA'nın çökelmesini sağlamak için tüpleri iki saat oda sıcaklığında bırakın.

Pelet santrifüjünün tutarlı bir şekilde lokalizasyonunu sağlamak için numuneleri, tüpler aynı yöne yönlendirilmiş bir mikro santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra 30 dakika boyunca 13.000 G'deki tüpler, numuneleri mikro santrifüjden aldı, daha sonra supernat uygulamasını dikkatlice aspire etti ve attı. Pelet bu aşamada parlak bir ışık kaynağı yardımıyla görünür olmalıdır.

Pelet santrifüjünü yıkadıktan sonra peleti 500 mikrolitre %70 etanol ile yıkayın. Santrifüjlemeyi takiben 10 dakika boyunca 13.000 G'deki numuneler, süpernatı dikkatlice aspire eder ve atar. Pelet şimdi daha görünür olacak, ancak tüp duvarından daha kolay ayrılacaktır.

Peletin oda sıcaklığında 15 dakika kurumasını bekleyin. Peletler kuruduktan sonra, her peleti 50 mikrolitre TE tamponunda askıya alın. Son olarak, yazılı protokolde tartışılan yöntemleri kullanarak gradyan fraksiyonlarını karakterize etmek için bir aeros jeli üzerinde her fraksiyonun beş mikrolitresini çalıştırın.

Tipik DNA SIP sonuçları, ultrasantrifüjleme ile gradyan formunda etiketli ve etiketsiz DNA'nın ayrılmasını gösterecektir. İdeal olarak, etiketlenmemiş materyalden karbon 13 ve nitrojen 15 gibi yüksek moleküler ağırlıklı genetik materyalin, özellikle kararlı izotop inkübe edilmiş numunelerin dört ila sekizinci fraksiyonlarıyla ilişkili benzersiz PCR tabanlı parmak izlerinden tam bir çözünürlüğü olacaktır, ancak doğal substrat ile değil. İnkübe edilmiş kontroller, iki saf kültürden, karbon 13 etiketli metil okcus kapsülit suş banyosundan ve etiketlenmemiş Sian medi A TCC 10 21'den DNA üzerinde gerçekleştirildiğinde, belirli organizmaları belirli etiketli substratın metabolizması ile ilişkilendiren güçlü kanıtlar sağlar, etiketlenmemiş bir genomik DNA olarak etiketlenmiş, farklı yoğunluklara sahip saygın gradyan fraksiyonlarına ayrılmıştır.

Bu örnekte, ağır izotop etiketli DNA, dört ila beş arasındaki fraksiyonlarda gözlemlenebilirken, etiketlenmemiş DNA, dokuz ila 10 arasındaki fraksiyonlarda yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Aynı fraksiyonlardan PCR amplifiye edilmiş DNA, denatüre ve gradyan jel elektroforezi veya DGGE kullanılarak çalıştırıldı ve gradyana dahil edilen iki organizmaya karşılık gelen ayrı bantlama modelleri oluşturdu. Fraksiyonların yoğunluğu mililitre başına yaklaşık 1.580 ila 1.759 gram arasında değişir ve soldan sağa azalan yoğunluk sırasına göre gösterilir.

Tersine, izotopların ayrılması ve çevresel numune inkübasyonlarının yorumlanması daha zor olabilir. Kanada, Resolute Körfezi'nden gelen tundra toprakları, 15 santigrat derecede 14 günlük bir süre boyunca karbon 12 veya karbon 13 etiketli glikoz ile inkübe edildi. Saflaştırılmış gradyan fraksiyon DNA'sının aeros jelleri, hem karbon 12 hem de karbon 13 inkübasyonları için yedi ila 10 fraksiyon boyunca yayma genomik DNA'sını ortaya çıkardı.

Bununla birlikte, belirli mikrobiyal taksonlardan, karbon 12 glikoz inkübe edilmiş topraktan biyokütlenin karbon 13 zenginleşmesini belirlemek için 16 s ribozomal RNA genlerinin DGGE'si kullanıldığında, DNA tüm gradyan fraksiyonlarında benzer desenler üretirken, karbon 13 glikoz inkübe edilmiş numune, beş ila sekiz arasındaki fraksiyonlarla benzersiz bir şekilde ilişkili DGG parmak izleri üretti, Oklarla gösterilen korunmuş bantlar, tüm gradyan fraksiyonlarında tutarlı olan baskın filo tipini temsil ediyordu. Filo tipi, karbon 13 glikoz inkübe edilmiş topraktan elde edilen DNA için daha ağır fraksiyonlara kayar. Bu özel 16 s ribozomal RNA geninin kimliği, sonraki metagenomik veya kültivasyon temelli yaklaşımlara rehberlik etmek için belirlenebilir.

Numunelerin inkübe edilmesinden moleküler analiz için etiketli DNA'nın elde edilmesine kadar bir DNA kararlı izotop sondalama deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, deneyinizi hızlı büyüyen organizmalara karşı önyargılı hale getirmekten kaçınmak için çok fazla substrat eklemekten kaçınmaya dikkat ederek deney tasarımınızı dikkatlice düşünmeniz önemlidir. Ayrıca, substratın bir besin ağı aracılığıyla bir topluluğun diğer üyelerine seyreltilmemesi için uzun süreli inkübasyondan kaçınmak istersiniz.

Bu nedenle, hassas PCR tabanlı uygulamalarla ağır fraksiyonlarda az miktarda etiketli DNA'yı tespit etmenize izin vermek için doğru miktarda substrat ve yeterli inkübasyon süreleri kullanmak istersiniz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.