DNA Kararlı-İzotop (DNA-SIP) Probing

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvar kültivasyonu gereksinimi olmaksızın, ilgilenilen bir büyüme substratını tüketmiş aktif mikroorganizmalardan DNA elde etmektir. Bu işlem, öncelikle bir çevre örneğinin, doğal ortamda bulunanlara benzer koşullar altında, ilgilenilen stabil izotopla işaretlenmiş bir substrat ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise bu izotopla işaretlenmiş örnekten toplam DNA'nın ekstrakte edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, bu DNA'yı sezyum klorür içinde yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonuna tabi tutmaktır. Prosedürün son adımı ise, sonraki moleküler karakterizasyon için ağır ve hafif DNA elde etmek amacıyla yoğunluk gradyanını fraksiyonlamaktır. Nihayetinde; parmak izi analizi, mikroarray, hibridizasyon, klon, kütüphane analizi ve metagenomik dahil olmak üzere çeşitli moleküler teknikler aracılığıyla, belirli bir substratın metabolizmasında yer alan ancak kültüre edilmemiş aktif mikroorganizmaların kimliğini ortaya çıkaran sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Waterloo Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Josh Neufeld. Ben de Neufeld Laboratuvarı'nda lisansüstü öğrencisi olan Eric Dunford. Bugün size, bilinmeyen ve potansiyel olarak kültüre edilemeyen mikroorganizmaların kimliklerini, ilgilenilen bir büyüme substratını kullanma yetenekleriyle ilişkilendirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelen DNA izotop probu veya DNA-SIP prosedürünü göstereceğiz.

Newfeld laboratuvarında, çeşitli karasal ve sulak ortamlardaki karbon kaynaklarının metabolizmasını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bugün, belirli bir karbon substratı olan 13 C glikozun bir toprak örneğine uygulanmasını göstereceğiz. Ancak, bu yöntem ilk kez Warwick Üniversitesi'ndeki Colin Merle grubu tarafından geliştirildiğinden beri, araştırmacıların protokolü çeşitli farklı ortamlara uygulayacak şekilde çeşitlendirdiklerini ve ayrıca nitrojen ile oksijen gibi çeşitli farklı işaretli izotoplar kullandıklarını belirtmek isteriz.

Bugün karbona odaklanacağız, ancak protokolün kendisi farklı deneysel tasarımlara uygulanabilir. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, tüm DNA stabil izotop probing veya DNA CYP reaktiflerini bu protokolün yazılı bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.

DNAC işlemi numunenin inkübasyonu ile başlar. İnkübasyon koşulları, çeşitli numune ve substrat özelliklerine bağlı olarak geniş ölçüde farklılık gösterir. Uygun inkübasyon koşulları ampirik olarak belirlendikten sonra, çevresel numuneye uygun substrat takviyesi ekleyin.

Test inkübasyonlarına bağlı olarak gerekiyorsa, mikrobiyal büyümeyi sağlamak için ek besin maddeleri eklemeyi de seçebilirsiniz. Numune inkübasyonu kurulduktan sonra numunenin kapağını kapatıp mühürleyin, ardından işaretli substrat içeren çevresel numuneleri inkübe edin. Gösterilen örnek, bir toprak numunesine karbon 13 işaretli glikoz çözeltisi eklenmesini içermektedir.

Ardından, sonraki adımlarda gözlemlenen nükleik asit işaretlemesini doğrulamak için karşılaştırma amacıyla bir kontrol inkübasyonu kurun. Bu örneği, substrat kapağı olarak işaretlenmemiş karbon kullanmak dışında aynı koşullar altında hazırlayın; çevresel örneği işaretlenmemiş substrat ile aynı koşullarda mühürleyip inkübe edin. İnkübasyonun ardından, mikrokozmoslardaki DNA'yı istenen sonraki uygulamalar için uygun olan bir ekstraksiyon protokolü kullanarak ekstrakte edin. Ardından, sonraki ultrasantrifüj adımları için ekstrakte edilen DNA'yı agaroz jel ve bir spektrofotometre kullanarak miktar tayinini yapın.

Hafif ve ağır DNA'nın mümkün olan maksimum ayrımını sağlamak için ultrasantrifüjleme sırasında dikey veya dikeye yakın rotorlar kullanın. Beckman Coulter VTI 65.2 rotoru, numuneleri ultrasantrifüjleme için hazırlamak amacıyla 5.1 millilitre hızlı mühürleme polimer tüplerini tutmak için 16 kuyucuğa sahiptir. Öncelikle, ultrasantrifüj tüplerine 0.5 ile beş mikrogram arası DNA eklemek için gereken ekstrakte edilmiş DNA hacmini hesaplayın.

Önceden belirlenen DNA konsantrasyonlarını kullanın. Ardından, dijital bir refraktometre kullanarak sezyum klorür stok çözeltisinin tam yoğunluğunu belirleyin. Yazılı protokolde önerildiği gibi, uygun bir karıştırma oranı oluşturmak için gerekli olan gradyan tampon DNA çözeltisinin hacmini hesaplayın.

Bu hesaplamaları kullanarak, ekstrakte edilen DNA'yı gradyan tamponu ve 4,8 mililitre sezyum klorür ile steril tek kullanımlık 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Santrifüj tüplerini tamamen doldurmak amacıyla, ortaya çıkan hacim tüplerin belirtilen kapasitesinden daha fazla olacaktır. Son olarak, tüpü 10 kez tersyüz ederek çözeltiyi hazırlayın; bu protokolün varyasyonları mevcuttur.

DNA'nın tüp içerisinde görselleştirilebilmesini sağlamak için gradyan çözeltisi içinde EtBr gibi bir florofor kullanın. Burada gösterildiği gibi bir EtBr gradyanı dahil olmak üzere, saf kültür DNA'sı ile hazırlandığında DNA'nın yoğunluğunun değiştirilmesi, her santrifüj sonrası gradyan oluşumunun anında görsel olarak doğrulanması açısından özellikle faydalıdır. Bu yaklaşımın kullanımındaki işlem adımları yazılı protokolde açıklanmıştır.

Ultrasantrifüj kurulumunu gerçekleştirmek için öncelikle, gradyan çözeltileriyle ultrasantrifüj tüplerini dikkatlice doldurmak için bir ampul ve pasaj pipeti kullanın. Tüplerin omuz kısmını ince uçlu kalıcı bir markör ile etiketleyin. Tüplerin tam olarak tüp boynu tabanına kadar doldurulduğundan emin olun; çünkü yetersiz doldurulmuş tüpler ultrasantrifüj sırasında patlama eğilimi gösterir.

Gerekli tüm tüpler örnek çözeltilerle doldurulduğunda, her bir tüpün kesin kütlesini kaydedin; tüpleri birbirine en yakın eşler şeklinde sıralayın ve 10 mg tolerans dahilinde dengelenene kadar çözeltiden ekleme veya çıkarma yapın. Çözelti seviyesini tüpün alt kısmına mümkün olduğunca yakın tutun. Ardından tüpleri, üretici talimatlarına uygun olarak tüp kapatıcı kullanarak mühürleyin.

Tüpleri ters çevirip orta derecede basınç uygulayarak düzgün şekilde mühürlendiklerini kontrol edin. Ultrasantrifüj öncesinde, mühürleme işleminden sonra tüplerin hala dengeli olduğunu kontrol etmek için tüpleri tekrar tartın. Ultrasantrifüj sırasında tüplerin delinmesine neden olabilecek toz ve kalıntılardan arındırılmış ve temiz olduklarından emin olmak için her bir rotor yuvasını dikkatlice inceleyin.

Dengelenmiş çiftleri karşılıklı gelecek şekilde yerleştirerek tüpleri rotora yerleştirin. Ultrasantrifüj işlemi işaretleme etiketlerini okunmaz hale getirebileceğinden, her örneğin rotordaki konumunu kaydedin. Rotor kuyucuklarını üreticinin belirttiği şekilde dikkatlice mühürleyin.

Rotor kuyucukları mühürlendikten sonra, rotoru ultrasantrifüje yerleştirin. Ultrasantrifüj kapağını kapatın ve VTI 65.2 rotoru için vakum uygulayın. Dönüş hızını 44.100 RPM, sıcaklığı 20 °C ve ultrasantrifüj süresini 36 ila 40 saat olarak ayarlayın.

Vakumun açık olduğundan emin olun, maksimum ivmelenmeyi seçin ve yavaşlamanın gradyanı bozmasını önlemek için freni kapatın. Ultrasantrifüj işleminin hemen ardından rotoru dikkatlice çıkarın. Tüplerdeki gradyanların bozulmasını önlemek için rotoru eğmemeye veya çarpmamaya özen gösterin.

Son olarak, gradyan fraksiyonasyonu için tüpleri nazikçe çıkarın. DNA, fraksiyonasyon tekniği kullanılarak ultrasantrifüj tüplerinden ekstrakte edilebilir. Başlamak için, steril 60 mililitrelik bir şırıngayı, yeterli miktarda propofol mavi boya içeren steril distile ve deiyonize su ile doldurun.

Koyu mavi renk sağlamak için şırıngayı şırınga pompasının yükleme koluna yerleştirin. Ardından, 23 gauge bir inçlik iğne takılı pompa tübünü bağlayın ve iğnenin ucundan bir miktar su gelene kadar pompayı çalıştırın. Su beslemesinde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin, çünkü bunlar fraksiyonlama sürecini olumsuz etkileyecektir.

Her bir örnek için, örnek numarasını ve fraksiyonu belirten etiketlerle 12 adet steril 1.5 milliliter mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Ardından, ultrasantrifüj tüplerinden birini hızlı ve kontrollü bir hareketle klempli bir standa sabitleyin. Yeni bir 23 gauge bir inç iğne kullanarak tüpün alt kısmını tüp dikişi boyunca delin ve üniform bir delik oluştuğundan emin olmak için iğneyi döndürün.

Lateks eldivenlerin, iğne şaftı üzerinde nitril eldivenlere göre daha iyi tutuş sağladığını görebilirsiniz. Pompa hortumuna bağlı olan iğneyi kullanarak, tüpün üst omuz kısmındaki dikiş hattı boyunca tüpün üst kısmını hızlı ve kontrollü bir şekilde delin. Tüpün önce üst kısmının, ardından alt kısmının delinebileceğini unutmayın.

Ayrıca, tüpün omuz kısmına sürülen az miktarda mineral yağın, önceden kalibre edilmiş bir pompa hızıyla üst iğne etrafındaki hatalı sızdırmazlıktan kaynaklanan sızıntıları önlemeye yardımcı olabileceğini unutmayın. Boyalı suyu, 12 dakikada 12 adet 425 microliter fraksiyon elde edecek şekilde tüpün üst kısmına pompalayın. Gradyan çözeltisini etiketli mikro santrifüj tüplerine toplamak için bir zamanlayıcı kullanın.

Son olarak, en az bir örnek veya kontrol gradyanı için tüm fraksiyonların yoğunluğunu kontrol edin. Bunun için dijital bir refraktometre kullanın. Tüm fraksiyonlardan DNA çöktürmek için değerlerin 1.690 ile 1.760 grams per milliliter aralığında ve medyan yoğunluğun yaklaşık 1.725 grams per milliliter olmasını bekleyin.

İlk olarak, çöktürme için taşıyıcı olarak 20 µg lineer poliakrilamid ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Ardından iki hacim PEG çözeltisi ekleyin ve tekrar ters çevirerek karıştırın. İnkübasyonun ardından DNA'nın çökelmesini sağlamak için tüpleri iki saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Pelletin tutarlı şekilde konumlanmasını sağlamak için tüpler aynı yöne bakacak şekilde mikro santrifüje yerleştirildi. Tüpler 13,000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjlendikten sonra mikro santrifüjden çıkarıldı, ardından süpernatan dikkatlice aspire edilerek atıldı. Bu aşamada pellet, güçlü bir ışık kaynağı yardımıyla görünür olmalıdır.

Pelleti santrifüjledikten sonra 500 µL %70 etanol ile yıkayın. Örnekleri 13,000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice aspire ederek atın. Pelet şu an daha görünür olacaktır ancak tüp duvarından daha kolay ayrılacaktır.

Peletin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kurumasına izin verin. Peletler kuruduktan sonra, her bir peleti 50 µL TE tamponu içerisinde süspanse edin. Son olarak, yazılı protokolde tartışılan yöntemleri kullanarak gradyan fraksiyonlarını karakterize etmek için her fraksiyondan beş µL'yi bir agaroz jele yükleyerek yürütün.

Tipik DNA SIP sonuçları, ultrasentrifüjasyon yoluyla gradyan formunda işaretli ve işaretlenmemiş DNA'nın ayrıldığını gösterecektir. İdeal olarak, karbon 13 ve azot 15 gibi yüksek moleküler ağırlıklı genetik materyalin işaretlenmemiş materyalden tamamen çözünürlüğü; özellikle stabil izotopla inkübe edilmiş örneklerin dört ila sekiz numaralı fraksiyonlarıyla ilişkili, ancak doğal substratla ilişkili olmayan, PCR tabanlı benzersiz parmak izleri görülecektir. İki saf kültürden (karbon 13 ile işaretlenmiş Methylococcus capsulatus suşu Bath ve işaretlenmemiş Cyanothece sp. ATCC 1021) elde edilen DNA üzerinde gerçekleştirildiğinde, inkübe edilmiş kontroller belirli organizmaları belirli işaretli substratların metabolizmasıyla ilişkilendiren güçlü kanıtlar sağlar; işaretli ve işaretlenmemiş genomik DNA, farklı yoğunluklara sahip ilgili gradyan fraksiyonlarına ayrılır.

Bu örnekte, ağır izotopla işaretlenmiş DNA dört ile beşinci fraksiyonlar arasında gözlemlenebilirken, işaretlenmemiş DNA dokuz ile 10. fraksiyonlarda yüksek konsantrasyonlarda bulunmaktadır. Aynı fraksiyonlardan elde edilen ve PCR ile amplifiye edilmiş DNA'lar, denatüre ve gradyan jel elektroforezi (DGGE) kullanılarak yürütülmüş ve gradyanda yer alan iki organizmaya karşılık gelen belirgin bant örüntüleri oluşturmuştur. Fraksiyonların yoğunlukları yaklaşık olarak 1.580 ile 1.759 gram/mililitre arasında değişmektedir ve soldan sağa doğru azalan yoğunluk sırasına göre gösterilmişlerdir.

Aksine, izotopların ayrılması ve çevresel örnek inkübasyonlarının yorumlanması daha zor olabilir. Kanada'nın Resolute Bay bölgesinden alınan tundra toprakları, 15 °C'de 14 günlük bir süre boyunca karbon 12 veya karbon 13 ile işaretlenmiş glikoz ile inkübe edilmiştir. Saflaştırılmış gradyan fraksiyon DNA'larının aero jelleri, hem karbon 12 hem de karbon 13 inkübasyonları için yedi ile onuncu fraksiyonlar arasında yayılmış genomik DNA göstermiştir.

Buna karşın, belirli mikrobiyal taksonların biyokütlesindeki karbon 13 zenginleşmesini belirlemek için 16 s ribozomal RNA genlerinin DGGE yöntemi kullanıldığında, karbon 12 glikoz ile inkübe edilen toprak DNA'sı tüm gradyan fraksiyonlarında benzer paternler oluştururken, karbon 13 glikoz ile inkübe edilen örnek, beş ile sekiz arasındaki fraksiyonlarla benzersiz şekilde ilişkili DGGE parmak izleri oluşturmuştur; oklarla belirtilen korunmuş bantlar, tüm gradyan fraksiyonlarında tutarlı olan baskın filotipleri temsil etmektedir. Karbon 13 glikoz ile inkübe edilen topraktan elde edilen DNA için filotip, daha ağır fraksiyonlara kaymaktadır. Sonraki metagenomik veya kültüre dayalı yaklaşımlara yön vermek amacıyla, bu özel 16 s ribozomal RNA geninin kimliği belirlenebilir.

Örneklerin inkübasyonundan, moleküler analiz için işaretli DNA'nın elde edilmesine kadar, bir DNA stabil izotop problama deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, deneysel tasarımınızı dikkatle değerlendirmeniz ve deneyinizi hızlı büyüyen organizmalar lehine yanlı hale getirmemek için çok fazla substrat eklememeye özen göstermeniz önemlidir. Ayrıca, substratın bir besin ağı aracılığıyla topluluktaki diğer üyelere dağılmasını önlemek için inkübasyon süresini gereğinden fazla uzatmamalısınız.

Böylece, hassas PCR tabanlı uygulamalarla ağır fraksiyonlardaki küçük miktardaki işaretli DNA'yı tespit edebilmenize olanak tanıyacak şekilde, tam olarak doğru miktarda substrat ve yeterli inkübasyon sürelerini kullanmış olacaksınız. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.