Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Bu video, döllenmeden sonraki birinci ila üçüncü günlerdeki zebra balığı embriyolarından retina ve retinal pigment epitelyumu (RPE) ekli retinanın mikrodiseksiyonunu göstermektedir. Tüm prosedürler ince pensetler ve genel laboratuvar malzemeleri ile gerçekleştirilebilir. Retina diseksiyonu için kullanılan standart stereo mikroskoplar altında, tek katmanlı RPE, fırçalama hareketi ve RPE'nin kültür plakası yüzeyine yapışması yoluyla uzaklaştırılır ve soyulur.

RPE bağlantılı retinal diseksiyon için, diseksiyondan önce kültür plağının yapışkan özellikleri embriyonik ezme ve yıkama ile ortadan kaldırılır. RPE'nin bütünlüğünü korumak için, bu dokunun dikkatlice kaldırılması koroid ve skleranın RPE bağlantılı retinadan etkili bir şekilde ayrılmasını sağlar; ardından kimyasal olarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanılarak lens çıkarılır. Bu diseksiyon yöntemi ile bütün retina dokuları elde edilebilir ve bu yöntem, dokuya özgü RNA ekspresyonunun, zebra balığı retinasının ve retinal pigment epitelyumunun profillerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır.

Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Profesör UFE Leon'un laboratuvarından Li Jang. Bugün size zebra balığı embriyonik göz dokularının nasıl diseke edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda göz gelişimini düzenleyen gen ağını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Sekiz. Mikrodissection öncesinde aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. E3 ortamı, filtre sterilize edilmiş ringer çözeltisi ve %5 normal sodyum hidroksit.

Ardından, tungsten iğneleri kimyasal olarak aşındırın. Beherin taşınmasını kolaylaştırmak ve sodyum hidroksit dökülmesini önlemek için küçük bir beheri bir Petri kabı içine kil ile sabitleyin. Beherin kenarına standart bir ataş takın.

Ataç sodyum hidroksite temas edene kadar behere beş normal sodyum hidroksit dökün. Bir DC güç kaynağının negatif elektrodunu ataça, pozitif elektrodunu ise kısa bir tungsten tel parçasının bir ucuna bağlayın. Tungsten telin diğer ucunu dört milimetre çapında bir kil topu ile sarın ve bu ucu sodyum hidroksit çözeltisine daldırın.

Voltajı yaklaşık üç volta yükseltin ve teli sodyum hidroksit çözeltisine yaklaşık 10 dakika boyunca, bir saniyelik aralıklarla yukarı ve aşağı daldırın. Sodyum hidroksite maruz kalan tungsten tel kademeli olarak incelirken, pozitif elektroda bağlı telin diğer tarafındaki kil topu düştüğünde keskin bir iğne şekli oluşacaktır. Tuz birikintilerini temizlemek için keskin iğneyi Ringer solüsyonu veya E3 ile durulayın ve embriyoları diseksiyona hazırlamak için kolay kullanım amacıyla iğneyi bir bant veya iğne tutucu yardımıyla ahşap bir aplikatöre sabitleyin.

Yetişkin süper balıkları, çiftleşmeden önceki gece standart protokollere uygun olarak muhafaza edin. Ebeveyn balıkları, statik üretim tanklarında bir bölme kullanarak çiftler halinde ayırın. Ertesi sabah oda ışıkları açıldıktan sonra bölmeyi kaldırın ve ebeveynlerin her yarım saatte bir, 10 dakikalık aralıklarla çiftleşmelerine izin verin; her çiftleşmeden sonra balıkları birbirinden ayırın.

Her bir çaprazlamadan toplanan embriyoları E three ortamında, 28 °C'de ayrı ayrı muhafaza edin. Embriyoları döllenmeden sonraki 10 ila 12. saatlerde evreleyin ve diseksiyon öncesindeki spesifik zaman noktalarında hemen yeniden evreleyin. Diseksiyon için Falcon 60 by 15 millimeter polistiren kültür plakaları kullanın.

Yeni kullanılmamış bir plaka, RPE dokusu için yaklaşık 20 dakikaya kadar doğal bir yapışma özelliğine sahiptir ve retinal diseksiyonlar için RPE'nin uzaklaştırılmasına yardımcı olabilir. Eğer RPE'li retina isteniyorsa, bu yapışma özelliği, iki embriyonun ringer solüsyonu içeren bir kültür plağında tamamen ezilip diseksiyon öncesinde 30 dakika bekletilmesi ve ardından diseksiyon öncesinde taze ringer solüsyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkanmasıyla aşılabilir. Tüm hassas diseksiyonlar, bir x objektifli bir Olympus SC X 16 mikroskobuyla yaklaşık beş ila sekiz x büyütmede gerçekleştirilir.

Dumont pensi veya kimyasal olarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanarak, mikroskop tablası 28 °C'ye ısıtılır. Sıcaklık dalgalanmalarının etkisini en aza indirerek retinal diseksiyona başlamak için, belirli bir gelişim evresindeki embriyoyu, RRPE'siz retinal diseksiyon için açıklandığı şekilde hazırlanan, 60 x 15 mm'lik bir Falcon kültür plağındaki 5 mL Ringer çözeltisine aktarın; pensin keskin ucuyla başı ve ön gövdenin bir kısmını keserek zebrafish vücudunu hızla uzaklaştırın. Ardından, baş-gövde kesitinin arka ucunu bir kültür plağına iğneleyin. Yardımcı pensle, ön alın bölgesinden başlayarak başı dorsal taraftan açın.

Gözlerin medial tarafı açığa çıkacak ve sonraki manipülasyonlar için yukarı bakacak şekilde beyni çıkarın. Retinayı diseke etmek için, retinada küçük bir açıklık görülene kadar, gözün yukarı bakan medial tarafındaki açığa çıkmış RPE'yi pensetin ucuyla dikkatlice fırçalayın. Retinanın medial tarafı neredeyse tamamen açığa çıkana kadar fırçalama ve soyma işlemine devam edin.

Kültür kabına bakan göz retinasındaki lateral RPE'nin çıkarılması sırasında, açığa çıkmış retinanın çizilmesini ve delinmesini önleyin. Kültür plakası yüzeyiyle yaklaşık 45 derecelik bir açı oluşturun ve gözü forsepsle hafifçe süpürün. Diseksiyon için, ayrılan RPE kısmını kültür plakasına sabitleyerek ora serrata'ya nispeten sıkı tutunmuş olan RPE'yi çıkarın.

Ardından, kalıntı RPE'leri temizlemek için retinayı nazikçe kaldırın ve kültür kabının yapışma özelliğinden yararlanarak lensi çıkarın. Kabın yüzeyine hafifçe yapışacak olan retinal hücrelere zarar vermemeye dikkat edin. Lens yuvarlama yöntemiyle ayrılmazsa, lens yüzeyine dairesel hareketler uygulayarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanın.

RPE ekli retina diseksiyonuna başlamak için, RPE ekli retina diseksiyonu için tarif edildiği şekilde hazırlanmış 60 x 15 milimetrelik bir Falcon kültür plakası kullanın. Belirli bir gelişim evresindeki embriyoyu beş mililitre ringer çözeltisine aktarın. Başı ve ön gövdenin bir kısmını kesin.

Daha önce yapıldığı gibi zebra balığı vücudu hızlıca çıkarılır. Baş gövde bölümünün arka ucu bir kültür plağına sabitlenir. Yardımcı pensetle, ön alın bölgesinden başlanarak başın dorsal tarafı açılır.

Gözlerin medial tarafı açığa çıkacak ve yukarı bakacak şekilde beyni çıkarın. Pensle yapılacak daha ileri manipülasyonlar için gözü posterior lateral taraftan nazikçe kaldırın ve anterior tarafa doğru yuvarlayın. RPE tabakasının dışındaki koroid ve sklera dokusu deriye nispeten sıkı bir şekilde yapışmıştır ve gözü dikkatlice anterior tarafa yuvarlayarak büyük oranda soyulabilir.

Gözün yan tarafı açığa çıkarıldıktan sonra ve retina diseksiyonu için göz henüz deriye bağlıyken, lensi tungsten iğne ile çıkarın. RPE ve RPE'ye bağlı retina olmadan, diseke edilen örnekler daha sonraki RNA karakterizasyonu için bir RNA mikro tüpündeki triol içerisine toplanabilir.

Retina yüzeyinin sağlam kaldığının görülmesiyle retinal bütünlüğün korunduğu, RPE olmaksızın gerçekleştirilen başarılı bir retinal diseksiyon burada gösterilmektedir. İlgili histolojik kesit de retinal mimarinin çok iyi korunduğunu göstermektedir. Özellikle, fotoreseptör tabakası ile RPE arasındaki hücre dışı matrisin korunması olağanüstü derecede iyidir.

Başarılı bir RPE ekli retinal diseksiyon, bozulmamış ve sürekli RPE tabakası ile gösterilir. İlgili histolojik kesit, hem retina hem de RPE hücrelerinin iyi durumda olduğunu göstermektedir. Disekte edilen retinalardan ekstrakte edilen toplam RNA yüksek kalitededir.

Bu durum, bioanalyzer analizinden elde edilen elektroferogram ve jel görüntüsü ile belirtilmektedir. Baz çizgisi düzdür ve 18 s ile 28 s ribozomal pikleri bozulmamıştır. RNA bütünlük numarası tipik olarak 9,8'den büyüktür.

Sizlere, RPE içeren ve içermeyen zebrafish embriyonik retinasını elde etmek için kullanılan mikro disseksiyon prosedürlerini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, retinal disseksiyondaki en kritik adımların pens uçlarının yaptığı süpürme hareketi ve dokunun yuvarlanması olduğunu hatırlamak önemlidir. RPE kalıntılarının temizlenmesi için, disseksiyon sırasında sandalyenizin ayarlanabilir kol dayama yerlerine dirseklerinizi koymanın el hareketlerini önemli ölçüde stabilize edebildiğini tespit ettik.

İşte hepsi. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.