Name: Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin zebra balığı embriyonik retinasının mikrodisseksiyon yöntemini; RPE'li ve RPE'siz dokuları izole ederek RNA analizi için sağlam örnekler hazırlayın. Bu teknik gelişim biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü&#39;nden mezun bir başlangıç ​​fonu tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: mikrodiseksiyon öncesi hazırlıklar <ol><li> Çözümler <ol class="lalpha"><li> E3 orta 4 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 ve 0.33 mM MgSO 4). </li><li> Zil çözümü 1, 5 (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), filtre sterilize edilmelidir. </li><li> 5N NaOH. </li></ol></li><li> Tungsten iğneler kimyasal aşındırma <ol class="lalpha"><li> Kil Petri kabı 5N NaOH içeren küçük bir beher sabitleyin. </li><li> NaOH çözeltisi ile temas halinde gelir, böylece beher tarafı bir kağıt klipsi takın. </li><li> Ataş ve kısa bir tungsten tel parçası (~ 2cm) bir ucunu pozitif elektrot için bir DC güç kaynağı negatif elektrot bağlayın. </li><li> Tungsten telin diğer ucunu küçük bir kil topu ile sarın ve NaOH çözeltisi Bu amaçla daldırma. </li><li> Yaklaşık 3V gerilimi artırmak ve iyi bir gravür oranı ulaşılana kadar NaOH çözeltisi tel daldırma ve aşağı. Kaliteli bir iğne genellikle 10 dakika içinde kazınacak. </li><li> Çözüm maruz tungsten tel giderek incelir. Kil topu kapalı düştüğünde, hala pozitif elektrot bağlı olduğu tel diğer tarafı keskin bir iğne şeklinde olacaktır. </li><li> Keskin iğne tuz yatakları kaldırmak için Ringer solüsyonu veya E3 ile durulayın. </li><li> Bantla ahşap bir aplikatör veya kolay kullanım için bir iğne tutucu iğne takın. </li></ol></li><li> Kültür plakalar <ol class="lalpha"><li> Falcon 60 x 15 mm polistiren kültür plakaları retina mikrodiseksiyon kullanmak için hazır. </li><li> RPE bağlı retina diseksiyon için Ringer diseksiyonu 30 dakika önce yüzeyin yapışkanlık kurtulmak için çözüm içeren bir kültür plaka tamamen iki embriyo ezmek. Diseksiyonu kısa bir süre önce, plaka yoğun taze Ringer solüsyonu ile yıkayın. </li></ol></li><li> Embriyolar toplama ve evreleme <ol class="lalpha"><li> Yetişkin zebrafish 4, 5 açıklandığı gibi korunur. </li><li> Bir bölücü tarafından ıslah gece önce ikili statik üreme tanklarında ana balık ayırın. </li><li> Oda ışığında ertesi sabah açıldıktan sonra bölücü çıkarın. Ebeveynlerin her yarım bir saat 10 dakikalık aralıklarla çapraz izin verin. Her geçtikten sonra balık ayırın. </li><li> 28 ayrı E3 orta her kapısında toplanan embriyolar koruyun ° C </li><li> Sahne embriyolar, 10 ila 12 saat sonra döllenme (hpf) ve restage hemen belirli bir zaman noktalarında diseksiyonu önce, belirlenmiş kriterlere 1, 6 göre . </li></ol></li></ol> Bölüm 2: Diseksiyon beyin kaldırma ve göz temasından 1 <ul><li> Bu bölümde açıklanan prosedürleri (Bölüm 3A) retina ve RPE bağlı retina (3B) diseksiyon için ortak. </li><li> Tüm Dumont forsepsi bir ucu ince diseksiyonları tarafından yapılan ve Dumont forseps doku konumlandırma için başka bir çifti tarafından yardım edilmektedir. Bir kimyasal kazınmış tungsten iğne gerekirse ince manipülasyonlar için kullanılabilir. </li><li> Tüm ince diseksiyonları ~ 5-8x büyütme 1X bir amaç ya da eşdeğeri ile donatılmış bir Olympus SZX16 mikroskop altında yapılmaktadır. </li><li> E3 ortamda embriyolar bakımını bir tezgah üstü inkübatör 28 ° C Diseksiyon sırasında kolay embriyo erişim için mikroskop yanında. </li><li> Bu mikroskop aşamasında, gen ekspresyonu üzerindeki sıcaklık dalgalanmasının etkisini en aza indirmek için bir termo levha ile 28 ° C'ye ısıtılır. </li></ul><ol><li> Part 1 # 3 açıklandığı gibi Ringer Falcon 60 x 15 mm kültür plakasına çözümü için belirli bir gelişim aşamasında embriyo transferi hazırladı. </li><li> Ön gövde parçası ile vücuttan hızlı bir şekilde kafasını kesti. </li><li> Yardımcı forseps ile kültür plaka üzerinde bu doku arka ucunu sabitleyin. </li><li> Dorsal tarafında ön alından başlayan baş açın. </li><li> Beyin gözlerin medial tarafında maruz kalır ve daha fazla manipülasyonlar için yukarı bakacak şekilde kaldırın. </li></ol> Bölüm 3A: Retina diseksiyon 1 <ol><li> Bölüm 2 de açıklandığı gibi embriyo hazırlayın. </li><li> Maruz RPE, retinanın küçük bir açılım görülüyor kadar forseps ucu yukarı bakacak şekilde göz topun medial tarafında dikkatlice fırçalayın. </li><li> Fırçalama ve eylem soyma retinanın iç tarafında, hemen hemen tüm maruz kadar devam edin. Çizilme ve maruz retina delme kaçının. </li><li> Şimdi aşağıya doğru bakacak şekilde retina, yaklaşım lateral RPE kaldırmak için olduğunu ve kültür plaka yüzeyinden yaklaşık 45 ° açıyla fırça. </li><li> C RPE müstakil bir kısmı iğneleyerek ora serrata nispeten sağlam bir şekilde bağlı olduğu RPE çıkarınulture diseksiyon için plaka ve retinanın hafifçe kaldırın. </li><li> Kalan RPE temizlemek için kültür çanak alt retina döndürün. <ol class="lalpha"><li> Biz bir embriyo ezilmiş bir kez bu özel Falcon polistiren kültür plakasına yaklaşık 20 dakika boyunca RPE tercihli bir bağlılık olduğunu fark etmişsinizdir. Bu özellik, RPE kalıntıların çıkarılması için kullanılmaktadır. Ancak, retinal hücreler yüzeye yüksek büyütme altında yakından kontrol edilebilir, daha az bir ölçüde, sopa. Bir RPE kaldırma ve retina bütünlüğünü eksiksiz arasında bir denge vardır. </li><li> Objektif genellikle kültür plakasına bağlıdır ve haddeleme işlemi sırasında retinadan ayrılır. Bazen, lens, lens yüzeyi üzerinde dönen eylem ile kazınmış bir tungsten iğne ile ayırmak için gereklidir. </li></ol></li><li> Bu prosedürler, doku bütünlüğü ödün vermeden başarıyla retinanın RPE kaldırmak. Bu iyi bir genel morfolojisi (Şekil 1B ve B ') ve histoloji (Şekil 1B ") ile gösterilir, ok fotoreseptör tabaka ve RPE arasında ekstraselüler matriks korunması, özellikle (Şekil 1B son derece iyi." bütün embriyo (Şekil 1A ")) histoloji ile karşılaştırın. </li></ol> Parça 3B: RPE bağlı retina diseksiyonu 3 <ol><li> Bölüm 2 de açıklandığı gibi embriyo hazırlayın. </li><li> Kültür plaka baş asistan forseps ile sabitleyin. Gözün arka yan taraftan hafifçe kaldırın ve ön tarafında roll. <ol class="lalpha"><li> RPE tabakasının dışında olası koroid ve skleral doku cilt nispeten sıkıca bağlı olan ve çoğunlukla ön tarafında dikkatle göz yuvarlayarak sıyrılır olabilir. </li></ol></li><li> Tungsten iğne ile lens gözün yan tarafında maruz kalır ve göz hala cilde takıldığında sonra çıkarın. </li><li> Bu prosedürler, retina ile tüm RPE başarıyla koruyabilirsiniz. Olası choroids ve skleral doku büyük ölçüde (Şekil 1C, C ve C ") silinebilir. </li></ol> Bölüm 4: Doku RNA çalışmaları için örnek toplama <ol><li> Disseke örnekleri 1 önce açıklandığı gibi downstream RNA karakterizasyonu için bir RNaz ücretsiz mikrofuge'de tüp TRIzol toplanabilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (A) Yanal ve diseksiyonu önce 52 hpf Zebra balığı larva kafa (A) dorsal. (A) ve (A ') (B) ve (B', 54 hpf disseke retina) dorsal Yanal retina yüzeyinde yatay hem de sağlam olduğu larva baş (A ") karşılık gelen histolojik bölüm ve dorsal kez (B) (B) ve (B ') disseke retina ilgili histolojik bölüm. Retina ve retina laminasyon yapısı bozulmamış oldu. Özellikle, fotoreseptör tabaka ve RPE (A arasındaki ekstraselüler matriks "(oklar, oklar) disseke retina B) korundu". (C) Yanal ve 52 hpf disseke RPE bağlı retina (C ') medial. RPE disseke doku histolojik kesiti (C) ile gösterilir olduğu, sağlam ve sürekli C 'beyaz alan optik sinir (ok). Histoloji, doku örnekleri% 4 toplanır ve fikse edildi 3 açıklandığı gibi paraformaldehid Plastik gömme ve bu örneklerin bir kesit yapıldı. Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Zebrafish göz dokularında Mikrodisseksiyon etkin bir şekilde sağlam retina ve RPE bağlı retina elde edebilirsiniz. Bu ifade belirli bir göz doku (yani retina veya RPE) ile ilgili çalışmalar önemli ölçüde yardımcı olur. Aslında, tüm retina 1 ve RPE 3 RNA ekspresyon profillerini elde etmek için bu işlemler başarıyla kullanmış olması. Bu profilleri programı güçlü bir retina farklılaşma mutant 2 tedirgin olan yollar ve gen ailelerinin son kimlik tarafından desteklenmektedir. Retina diseksiyo...

<table><tbody><tr><td>Kablosuz havan motoru</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>DC güç kaynağı</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Herhangi bir DC güç kaynağı uygun olacaktır. Farklı bir cihazın spesifik voltajının ayrıca optimize edilmesi gerekecektir.</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık havan eli &amp;amp; mikrotüp, 1,5 mL (DNaz, RNaz ve pirojen içermeyen)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Bunlar, ekspresyon analizi için dokuların TRIzol içerisinde toplanmasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Dumont #5 pens, Uçlar: 0,05 x 0,01 mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>İnce uç boyutu tercih edilir ancak kesin bir zorunluluk değildir; çünkü ucun zaman zaman bilenmesi gerekebilir.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF penset, Uçlar: 0,025 x 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>İnce uç boyutu arzu edilir ancak esnektir; zira ucun zaman zaman bilenmesi gerekebilir.</td></tr><tr><td>Falcon polistiren kültür plakaları, 60 X 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Bu plakalar diseksiyon plakaları olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 Stereomikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Herhangi bir stereomikroskop kullanılabilir. Önceki çalışmalarda Leica stereomikroskop kullandık.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; herhangi bir sorun oluşmadan. Ayrıca, 2X objektif takılı olmasına rağmen, diseksiyon işlemi için yalnızca 1X objektifi kullanıyoruz. </td></tr><tr><td>Bileme taşı</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Gerektiğinde forseps ucunu sivriltmek için bunu kullanın</td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Bu, diseksiyon boyunca dokunun sıcaklığını korumak ve sıcaklık dalgalanmasının gen ekspresyonu üzerindeki etkisini minimize etmek için kullanılır. Ayrıca mikroskobun tamamını 28°C sıcaklığa sahip, çevresel olarak kontrollü bir odaya yerleştirdik.&amp;#x00B0;önceki çalışmalarda diseksiyon sırasında C&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; başarıyla.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>tungsten tel, 0,015 inç çapında</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Ahşap Uygulama Çubuğu</td><td>Puritan</td><td>807</td><td>Bu, kimyasal olarak aşındırılmış tungsten iğneyi tutmak için kullanılır.</td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyonik göz dokular, mikrodisseksiyon

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebra balığı nedeniyle hızlı göz gelişimi üzerinde bir araştırma için popüler bir hayvan modeli<em&gt; Eski utero</em&gt; Geliştirme ve iyi fekondite. 3 gün fertilizasyon (dpf), larvaların ilk görsel tepki gösterecektir. Uygun bir gözün gelişimini kontrol etmek için Birçok genler tespit, ancak altta yatan genetik mimarisinin tam bir anlayış uzak olmuştur. Tüm genom gen ekspresyonu, göz gelişimi için genetik düzenleyici ağ aydınlatmak için yararlı bir araçtır. Ancak, embriyonik zebrafish göz küçük boyutu, zorlu ekspresyon analizi için sağlam ve saf göz dokularında elde etmek için yapar. Örneğin objektif çapı az 100 mikron iken, günde 2 ile 3 arasında gözün ön-arka uzunluğu, sadece yaklaşık 200-300 mm. Ayrıca, retina altında yatan retina pigment epitel (RPE), sadece bir tek katlı epitel. Gen ekspresyon profilleri bütün embriyo elde edilebilir olsa da, onlar doğru bu dokuların ifade temsil yoktur. Bu nedenle saf doku göz gelişimi başarılı bir gen ekspresyon profili için alınmalıdır. Bu sorunu gidermek için, göz morfolojilerinden önemli aşamaları kapsayan RPE ile 1-3 dpf&#39;e bağlı sağlam retina ve retina, microdissect bir yaklaşım geliştirdik. Tüm işlemler, standart stereomicroscopes altında ince forseps ve genel laboratuar gereçleri ile yapılabilir. Retina diseksiyon için, tek katmanlı RPE kaldırılır ve eylem ve tercihli bağlılık diseksiyon için kültür plaka yüzeyine RPE kalıntıları fırçalama sıyrılır. RPE retinanın tamamen korunmuş böylece RPE bağlı retina diseksiyon için, RPE diseksiyonu plaka bağlılık diseksiyonu önce çıkarılması. Bu doku dikkatli bir kaldırma eylemi verimli olası koroid ve sklera ayırabilirsiniz. Objektif, kimyasal olarak kazınmış bir tungsten iğne ile her iki durumda da kaldırılabilir. Kısacası, bizim yaklaşımımız sağlam göz dokularını almak ve başarıyla zebrafish retina doku-spesifik ekspresyon profillerini incelemek için kullanılmıştır.<sup&gt; 1, 2</sup&gt; Ve retinal pigment epitel<sup&gt; 3</sup&gt;.

Bu makalede, retina pigment epitel birini üç gün postfertilization embriyolar bağlı olan ve olmayan zebrafish retina microdissect bir yaklaşım açıklanmıştır.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish, hızlı ex utero gelişimi ve yüksek fekonditesi nedeniyle göz gelişimi araştırmaları için popüler bir hayvan modelidir. Fertilizasyondan sonraki 3. güne gelindiğinde...

Bu video, döllenmeden sonraki birinci ila üçüncü günlerdeki zebra balığı embriyolarından retina ve retinal pigment epitelyumu (RPE) ekli retinanın mikrodiseksiyonunu göstermektedir. Tüm prosedürler ince pensetler ve genel laboratuvar malzemeleri ile gerçekleştirilebilir. Retina diseksiyonu için kullanılan standart stereo mikroskoplar altında, tek katmanlı RPE, fırçalama hareketi ve RPE'nin kültür plakası yüzeyine yapışması yoluyla uzaklaştırılır ve soyulur.RPE bağlantılı retinal diseksiyon için, diseksiyondan önce kültür plağının yapışkan özellikleri embriyonik ezme ve yıkama ile ortadan kaldırılır. RPE'nin bütünlüğünü korumak için, bu dokunun dikkatlice kaldırılması koroid ve skleranın RPE bağlantılı retinadan etkili bir şekilde ayrılmasını sağlar; ardından kimyasal olarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanılarak lens çıkarılır. Bu diseksiyon yöntemi ile bütün retina dokuları elde edilebilir ve bu yöntem, dokuya özgü RNA ekspresyonunun, zebra balığı retinasının ve retinal pigment epitelyumunun profillerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır.Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Profesör UFE Leon'un laboratuvarından Li Jang. Bugün size zebra balığı embriyonik göz dokularının nasıl diseke edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda göz gelişimini düzenleyen gen ağını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Sekiz. Mikrodissection öncesinde aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. E3 ortamı, filtre sterilize edilmiş ringer çözeltisi ve %5 normal sodyum hidroksit.Ardından, tungsten iğneleri kimyasal olarak aşındırın. Beherin taşınmasını kolaylaştırmak ve sodyum hidroksit dökülmesini önlemek için küçük bir beheri bir Petri kabı içine kil ile sabitleyin. Beherin kenarına standart bir ataş takın.Ataç sodyum hidroksite temas edene kadar behere beş normal sodyum hidroksit dökün. Bir DC güç kaynağının negatif elektrodunu ataça, pozitif elektrodunu ise kısa bir tungsten tel parçasının bir ucuna bağlayın. Tungsten telin diğer ucunu dört milimetre çapında bir kil topu ile sarın ve bu ucu sodyum hidroksit çözeltisine daldırın.Voltajı yaklaşık üç volta yükseltin ve teli sodyum hidroksit çözeltisine yaklaşık 10 dakika boyunca, bir saniyelik aralıklarla yukarı ve aşağı daldırın. Sodyum hidroksite maruz kalan tungsten tel kademeli olarak incelirken, pozitif elektroda bağlı telin diğer tarafındaki kil topu düştüğünde keskin bir iğne şekli oluşacaktır. Tuz birikintilerini temizlemek için keskin iğneyi Ringer solüsyonu veya E3 ile durulayın ve embriyoları diseksiyona hazırlamak için kolay kullanım amacıyla iğneyi bir bant veya iğne tutucu yardımıyla ahşap bir aplikatöre sabitleyin.Yetişkin süper balıkları, çiftleşmeden önceki gece standart protokollere uygun olarak muhafaza edin. Ebeveyn balıkları, statik üretim tanklarında bir bölme kullanarak çiftler halinde ayırın. Ertesi sabah oda ışıkları açıldıktan sonra bölmeyi kaldırın ve ebeveynlerin her yarım saatte bir, 10 dakikalık aralıklarla çiftleşmelerine izin verin; her çiftleşmeden sonra balıkları birbirinden ayırın.Her bir çaprazlamadan toplanan embriyoları E three ortamında, 28 °C'de ayrı ayrı muhafaza edin. Embriyoları döllenmeden sonraki 10 ila 12. saatlerde evreleyin ve diseksiyon öncesindeki spesifik zaman noktalarında hemen yeniden evreleyin. Diseksiyon için Falcon 60 by 15 millimeter polistiren kültür plakaları kullanın.Yeni kullanılmamış bir plaka, RPE dokusu için yaklaşık 20 dakikaya kadar doğal bir yapışma özelliğine sahiptir ve retinal diseksiyonlar için RPE'nin uzaklaştırılmasına yardımcı olabilir. Eğer RPE'li retina isteniyorsa, bu yapışma özelliği, iki embriyonun ringer solüsyonu içeren bir kültür plağında tamamen ezilip diseksiyon öncesinde 30 dakika bekletilmesi ve ardından diseksiyon öncesinde taze ringer solüsyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkanmasıyla aşılabilir. Tüm hassas diseksiyonlar, bir x objektifli bir Olympus SC X 16 mikroskobuyla yaklaşık beş ila sekiz x büyütmede gerçekleştirilir.Dumont pensi veya kimyasal olarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanarak, mikroskop tablası 28 °C'ye ısıtılır. Sıcaklık dalgalanmalarının etkisini en aza indirerek retinal diseksiyona başlamak için, belirli bir gelişim evresindeki embriyoyu, RRPE'siz retinal diseksiyon için açıklandığı şekilde hazırlanan, 60 x 15 mm'lik bir Falcon kültür plağındaki 5 mL Ringer çözeltisine aktarın; pensin keskin ucuyla başı ve ön gövdenin bir kısmını keserek zebrafish vücudunu hızla uzaklaştırın. Ardından, baş-gövde kesitinin arka ucunu bir kültür plağına iğneleyin. Yardımcı pensle, ön alın bölgesinden başlayarak başı dorsal taraftan açın.Gözlerin medial tarafı açığa çıkacak ve sonraki manipülasyonlar için yukarı bakacak şekilde beyni çıkarın. Retinayı diseke etmek için, retinada küçük bir açıklık görülene kadar, gözün yukarı bakan medial tarafındaki açığa çıkmış RPE'yi pensetin ucuyla dikkatlice fırçalayın. Retinanın medial tarafı neredeyse tamamen açığa çıkana kadar fırçalama ve soyma işlemine devam edin.Kültür kabına bakan göz retinasındaki lateral RPE'nin çıkarılması sırasında, açığa çıkmış retinanın çizilmesini ve delinmesini önleyin. Kültür plakası yüzeyiyle yaklaşık 45 derecelik bir açı oluşturun ve gözü forsepsle hafifçe süpürün. Diseksiyon için, ayrılan RPE kısmını kültür plakasına sabitleyerek ora serrata'ya nispeten sıkı tutunmuş olan RPE'yi çıkarın.Ardından, kalıntı RPE'leri temizlemek için retinayı nazikçe kaldırın ve kültür kabının yapışma özelliğinden yararlanarak lensi çıkarın. Kabın yüzeyine hafifçe yapışacak olan retinal hücrelere zarar vermemeye dikkat edin. Lens yuvarlama yöntemiyle ayrılmazsa, lens yüzeyine dairesel hareketler uygulayarak aşındırılmış bir tungsten iğne kullanın.RPE ekli retina diseksiyonuna başlamak için, RPE ekli retina diseksiyonu için tarif edildiği şekilde hazırlanmış 60 x 15 milimetrelik bir Falcon kültür plakası kullanın. Belirli bir gelişim evresindeki embriyoyu beş mililitre ringer çözeltisine aktarın. Başı ve ön gövdenin bir kısmını kesin.Daha önce yapıldığı gibi zebra balığı vücudu hızlıca çıkarılır. Baş gövde bölümünün arka ucu bir kültür plağına sabitlenir. Yardımcı pensetle, ön alın bölgesinden başlanarak başın dorsal tarafı açılır.Gözlerin medial tarafı açığa çıkacak ve yukarı bakacak şekilde beyni çıkarın. Pensle yapılacak daha ileri manipülasyonlar için gözü posterior lateral taraftan nazikçe kaldırın ve anterior tarafa doğru yuvarlayın. RPE tabakasının dışındaki koroid ve sklera dokusu deriye nispeten sıkı bir şekilde yapışmıştır ve gözü dikkatlice anterior tarafa yuvarlayarak büyük oranda soyulabilir.Gözün yan tarafı açığa çıkarıldıktan sonra ve retina diseksiyonu için göz henüz deriye bağlıyken, lensi tungsten iğne ile çıkarın. RPE ve RPE'ye bağlı retina olmadan, diseke edilen örnekler daha sonraki RNA karakterizasyonu için bir RNA mikro tüpündeki triol içerisine toplanabilir.Retina yüzeyinin sağlam kaldığının görülmesiyle retinal bütünlüğün korunduğu, RPE olmaksızın gerçekleştirilen başarılı bir retinal diseksiyon burada gösterilmektedir. İlgili histolojik kesit de retinal mimarinin çok iyi korunduğunu göstermektedir. Özellikle, fotoreseptör tabakası ile RPE arasındaki hücre dışı matrisin korunması olağanüstü derecede iyidir.Başarılı bir RPE ekli retinal diseksiyon, bozulmamış ve sürekli RPE tabakası ile gösterilir. İlgili histolojik kesit, hem retina hem de RPE hücrelerinin iyi durumda olduğunu göstermektedir. Disekte edilen retinalardan ekstrakte edilen toplam RNA yüksek kalitededir.Bu durum, bioanalyzer analizinden elde edilen elektroferogram ve jel görüntüsü ile belirtilmektedir. Baz çizgisi düzdür ve 18 s ile 28 s ribozomal pikleri bozulmamıştır. RNA bütünlük numarası tipik olarak 9,8'den büyüktür.Sizlere, RPE içeren ve içermeyen zebrafish embriyonik retinasını elde etmek için kullanılan mikro disseksiyon prosedürlerini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, retinal disseksiyondaki en kritik adımların pens uçlarının yaptığı süpürme hareketi ve dokunun yuvarlanması olduğunu hatırlamak önemlidir. RPE kalıntılarının temizlenmesi için, disseksiyon sırasında sandalyenizin ayarlanabilir kol dayama yerlerine dirseklerinizi koymanın el hareketlerini önemli ölçüde stabilize edebildiğini tespit ettik.İşte hepsi. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Lens geliştirme, diğer dokuları ile etkileşimleri içerir. Çeşitli zebrafish göz mutantlar anormal küçük bir lens boyutuna göre karakterize edilir. İşte biz bu fenotip içsel nedenler veya objektif çevreleyen dokuların arızalı etkileşimler nedeniyle olup olmadığını belirlemek için bir lens nakli deney göstermektedir.

Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

Bu videoda, kortikal lens morfolojisini ve lens sütürlerinin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için yetişkin ve larva zebra balığı lenslerini incelemek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Göz Lensi Diseksiyonu: Zebra Balığı Lens Morfolojisini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Bu iletişim kuralı süper çözünürlük ışık mikroskobu birleştiriliyor ve elektron mikroskobu görüntüleri taramak Zebra balığı retina üzerinde hücre altı protein yerelleştirme sonuçları elde etmek için gerekli adımları açıklar.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

Burada, Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara kolay bir analizini neoangiogenesis ve yapısal değişiklikler bağlantılı uzun vadeli vasküler patolojiler ayarlarında bir hızlı okuma olarak sağlayacak bir yöntem protokol tartışmak.

Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.

Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Burada, elde edilen verileri analiz etmek için ticari olarak temin edilebilen bir ışık tabakası mikroskobu ve bir görüntü işleme iş istasyonu kullanılarak oküler morfogenezin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, embriyo anestezisi, düşük erime sıcaklığında agaroza gömülme, görüntüleme odasında süspansiyon, görüntüleme parametrelerinin ayarlanması ve son olarak görüntü analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme verilerinin analiz edilmesi prosedürlerini...

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Öğrenin zebra balığı embriyonik retinasının mikrodisseksiyon yöntemini; RPE'li ve RPE'siz dokuları izole ederek RNA analizi için sağlam örnekler hazırlayın. Bu teknik gelişim biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında kullanılır.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Daha fazla video keşfet