JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:11 dk • April 30th, 2023
- Organoidler, dokuya özgü kök hücrelerden türetilen küçük, üç boyutlu hücre kültürleridir. Genomik olarak stabildirler, ancak transfeksiyon yoluyla genetik olarak değiştirilebilirler ve bu nedenle genetik araştırma için idealdirler. Transfeksiyon için, organoidleri çok kuyulu bir kültür plakasında belirli bir kültür ortamı ile tohumlayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. Daha sonra, organoid hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için plakaya bir ayrışma karışımı ekleyin. Karışımı bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin. Organoid peleti, floresan etiketli plazmit DNA içeren bir elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Tampon hücreleri stabilize eder ve elektriksel strese bağlı hücre ölümünü önler.
Karışımı bir küvete aktarın ve hücreleri elektropore edin. Hücre zarı boyunca elektriksel uyarılar, plazmit DNA'nın hücreye alımını kolaylaştırmak için geçici gözenek oluşumuna neden olur. Elektroporasyondan sonra, hemen hücre süspansiyonuna kültür ortamı ekleyin ve karışımı bir tüpe aktarın. Şimdi, hücreleri santrifüjleyin. Peleti bodrum matrisinde yeniden süspanse edin ve polimerizasyon için çok kuyulu plakaya aktarın. Plakayı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve hücrelerde floresan olup olmadığını kontrol edin, bu da verimli transfeksiyonu doğrular. Aşağıdaki protokolde, gastrointestinal organoidleri transfekte etmek için elektroporasyon yapacağız.
- Elektroporasyon sonrası tohumlama için 48 oyuklu plakaları 37 santigrat derecede önceden ısıtarak başlayın, ardından el yazması talimatlarına göre bazal ve organoid kültüre özgü ortamlar hazırlayın. 48 oyuklu bir plakada elektroporasyon numunesi başına beş kuyu organoid yetiştirin. Oyuk başına 10 mikromolar Y27632 ile 230 mikrolitre ayrışma reaktifi hazırlayın. Organoidleri mikroskop altında izleyin. Kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve hazırlanan ayrışma karışımında organoidleri mekanik olarak ayrıştırın. Elektroporasyon numunesi başına beş kuyuyu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Tüpün içeriğini girdaplayarak karıştırın ve 10 ila 15 hücreden oluşan kümeler oluşana kadar 37 santigrat derecede 5 ila 15 dakika inkübe edin ve ayrışmayı mikroskopla kontrol edin. Antibiyotiksiz 10 mililitreye kadar bazal ortam ekleyerek sindirimi durdurun. Tüpü beş dakika boyunca 450 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 4 mililitre elektroporasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Yıkamalardan sonra, organoid peletini 30 mikrogram plazmit DNA ile 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
Tam DNA-organoid karışımını bir elektroporasyon küvetine dağıtın. Hava kabarcıklarından kaçındığınızdan emin olun. Elektroporasyon parametrelerini metin el yazmasında açıklandığı gibi ayarlayın ve hücreleri nazikçe karıştırmak için küvete parmağınızla vurun. Küveti küvet haznesine yerleştirin ve empedans değerini not etmek için elektroporatör üzerindeki empedans düğmesine basın. Elektroporasyon programını başlatmak ve görüntülenen akımların, voltajların ve enerjilerin değerlerini kontrol etmek için Başlat düğmesine basın.
Elektroporasyondan sonra hemen hücrelere 500 mikrolitre antibiyotiksiz kültür ortamı ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numuneyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve kalan hücreleri toplamak için küveti bazal ortamla durulayın, ardından hücreleri oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 450 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 100 mikrolitre bodrum matrisinde yeniden süspanse edin ve önceden ısıtılmış 48 oyuklu bir plakada 20 mikrolitrelik damlalar ekin.
Polimerizasyon için plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve oyuk başına Y27632 ve CHIR-99021 ile takviye edilmiş 250 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Transfeksiyon verimliliğini belirlemek için, 24 ila 48 saat sonra mikroskop altında transfeksiyon kontrolündeki floresansı kontrol edin.