JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 5:00 dk. • April 30th, 2023
- Aktive edilmiş T hücreleri, pankreas tümörü mikro çevresine hareket eder, burada interferon-gama veya IFN gama gibi sitokinleri ve etkili bir antitümör yanıtına aracılık etmeye yardımcı olan tümör nekroz faktörü-alfa veya TNF alfa salgılarlar. Sitokinler hızla T hücresinden dışarı çıktıkça, hücre içi seviyeler tespit edilemeyebilir. Bu nedenle, T hücresi, tümördeki terapötik rollerini incelemek için bazal sitokin üretimini artırmak için stimülasyona ihtiyaç duyar.
Farenin pankreasından tümör hücrelerinin bir süspansiyonunu alarak başlayın. Şimdi, hücre süspansiyonunda bulunan T hücrelerini bir sitokin stimülasyon kokteyli ile tedavi edin ve karışımı istenen süre boyunca inkübe edin. Bu kokteyl, kalsiyum iyonlarının endoplazmik retikulumdan sitoplazmaya salınmasını kolaylaştırır. Yüksek kalsiyum seviyeleri, sırayla, belirli nükleer transkripsiyon faktörlerini aktive ederek T hücrelerinde sitokin üretiminde bir artışa yol açar.
Daha sonra, hücreleri bir protein taşıma inhibitörü kokteyli ile tedavi edin ve tüpü inkübe edin. Bu kokteyl, endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine sitokin taşınmasını bloke ederek hücre içinde sitokin birikimine neden olur. Son olarak, akış sitometrisi analizi için uygun hücre içi belirteçleri kullanarak hücreleri boyayın. Aşağıdaki protokolde, hücre içi sitokin konsantrasyonunu artırmak için T hücre stimülasyonu yapacağız.
- Başlamak için, tümörü bir Petri kabına aktarmak için forseps kullanın. Enzim aktivitesinin başlamasını önlemek için 5 mililitrelik bir tüpte 50 mililitre sindirim ortamını buz üzerinde saklayın. Petri kabındaki tümörü kaplamak için bu çözeltiden küçük bir alikot alın. Tümörü kabaca 3 milimetreden daha kısa olan küçük parçalara kesmek için steril bir neşter ve forseps kullanın. Tümör parçalarını tüpe kazıyın ve tüm parçalar sindirim ortamına batırılana kadar tüpü nazikçe ters çevirin. Tüpü sindirmek için 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir çalkalama cihazına aktarın. Tüm tümör parçalarının suya batırıldığından ve tüpün kenarına yapışmadığından emin olun.
Sindirim adımından hemen sonra, enzim aktivitesini yavaşlatmak için tüpü buzun üzerine yerleştirin. 20 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için EDTA ekleyin ve enzim aktivitesini daha da yavaşlatmak için numuneyi karıştırmak için kısaca girdap haline getirin. Tüpü açın ve tüpün kapağındaki herhangi bir tümör sindirimini taze RPMI ortamı ile durulayın. Ardından 70 mikronluk bir süzgeç hazırlayın. Buz üzerinde 50 mililitrelik açık bir tüpe yerleştirin. Filtreyi orta ile önceden ıslatın. Sindirilmiş hücreleri yeniden askıya alın ve tüpün kenarlarını 25 mililitre veya daha büyük bir şerit kullanarak yıkayın. Şeridin daha geniş açılması, kalın sindirimin kolayca geçmesini sağlar.
25 mililitrelik şeridi kullanarak tüm sindirimi süzgecin üzerine aktarın. 1 mililitrelik bir şırınga pistonu kullanarak filtrenin üstündeki tümörü yukarı ve aşağı ezin. Hücreleri RPMI ile süzgeçten sürekli olarak yıkayın. Hücreleri itmek için yeterli kuvvetle yıkadığınızdan emin olun. Tüm hücreler süzgeçten geçene kadar yıkamaya devam edin. Tüpü 300 kez g ve 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin ve RPM'yi tamamlayın ve yeterince yeniden süspanse edilemeyen hücre dışı matrisi veya büyük hücre kümelerini çıkarmak için doğrudan başka bir filtreden geçirin. Herhangi bir stimülasyon gerekmiyorsa, izole edilen hücreleri akış sitometrisi analizi için hemen boyayın veya FBS'de% 10 DMSO'luk dondurucu ortamda yeniden süspanse edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Stimülasyonu gerçekleştirmek için önce hücreleri sayın. 100 mikrolitre başına 2 kez 10 ila 6 arasında bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri tam ortamda seyreltin. U tabanlı 96 kuyulu bir plakanın her bir oyuğunda 100 mikrolitre hücre plakası. 2X PMA ve iyonomisin preparatını içeren 100 mikrolitre tam ortam ekleyin. Plakayı bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, sırasıyla 1.06 mikromolar ve 2.0 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için 10X Brefeldin-A ve Monensin preparatından 20 mikrolitre ekleyin ve ortamı tamamlayın. Plakayı dört saat daha inkübatöre geri koyun.