Pankreas Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiklerini Görüntüleme: Pankreas Adacığındaki Sitozolik Kalsiyum Konsantrasyonundaki Gerçek Zamanlı Değişiklikleri İncelemek İçin Bir Teknik

- Pankreas adacıkları, glikoz homeostazının korunmasında çok önemli bir rol oynayan hormon üreten pankreas hücrelerinin bir kümesidir. Yüksek glikoz konsantrasyonu, potasyum iyon kanallarının kapanmasını tetikleyerek potasyum iyonu akışını önler ve membran depolarizasyonuna yol açar. Sonuç olarak, voltaja bağlı kalsiyum iyon kanalları açılır ve kalsiyum iyonlarının akışına izin verir. Bu artan sitozolik kalsiyum konsantrasyonu, insülin gibi hormonların salınımını uyarır. Gerçek zamanlı olarak, sitozolik kalsiyum dinamiklerini görüntülemek için, önceden monte edilmiş ince bir ağın ara duvarları arasına uygun kalsiyum indikatör boyası ile yüklenmiş birkaç adacığı aktarın.

Ağı, ters çevrilmiş bir mikroskobun görüntüleme odasının içine yerleştirilmiş bir lamel üzerine baş aşağı yerleştirin. Hücreleri hareketsiz hale getirmek için kaba bir ağ ve ağırlık yerleştirin. Hazneye görüntüleme solüsyonu ekleyin. Daha sonra, glikoz veya ilgilenilen bir test hormonu eklemek için bir perfüzyon sistemi kurun. Hücreler içinde, önceden yüklenmiş floresan kalsiyum göstergeleri, sitozolik kalsiyum konsantrasyonlarında herhangi bir artış olduğunu bildirir. Kalsiyum iyonlarına bağlandıktan sonra, indikatör moleküller floresan emisyonunda önemli bir artış gösterir. Aşağıdaki protokolde, glukoz perfüzyonuna yanıt olarak murin pankreas adacıklarında kalsiyum dinamiklerinin gerçek zamanlı görüntülemesini göstereceğiz.

- Görüntüleme için adacıkları hareketsiz hale getirmek için, ters çevrilmiş bir mikroskop için bir görüntüleme odası monte edin ve odanın içine bir cam lamel yerleştirin. Cam hazne arayüzünün su geçirmez olduğundan emin olun ve lamel mikroskop objektifinin erişebileceği bir yerde olduğundan emin olun. Daha sonra, 20 X 20 milimetre karelik ince ve kaba ağ kesin ve bir parça ince ağ üzerinde iki ara duvar oluşturmak için 45 ila 50 mikrometre kalınlığında yapışkan bant kullanın. Kaba ağı ve ağırlığı 35 milimetrelik bir Petri görüntüleme çözeltisi kabına daldırın ve ince ağı bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

İnce ağı, ara duvarları ters ve ara parçalar yukarı bakacak şekilde çevirin ve iki ara parça arasında birkaç adacık aktarmak için bir P20 pipeti kullanın. Saatçi forsepslerini kullanarak, ağı, ters çevrilmiş mikroskobun görüntüleme odasının içine baş aşağı yerleştirin, böylece ara parçalar aşağı bakacak ve doğrudan oda lamel üzerine oturacak şekilde adacıkları ara parçalar ile lamel ortasındaki ağ arasında sıkıştırın.

- Ağın, numunenin yanal hareketine neden olacak aşırı miktarda çözelti içermeden iyi bir şekilde nemlendirilmesine dikkat edin.

- Ardından, kaba ağı ve ağırlığı haznedeki ince ağın üzerine yerleştirin ve hazneye görüntüleme solüsyonu ekleyin. Adacıklar hareketsiz hale getirildikten sonra, ters çevrilmiş mikroskopta görüntüleme modunu ve objektifi seçin ve odacıkların bulunduğu odayı mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına yerleştirin. Perifüzyonu ayarladıktan sonra, girişi oda içindeki çıkıştan daha düşük konumlandırın ve çıkış akışını giriş akısından daha büyük olacak şekilde ayarlayın.

Çıkış akışının çözelti ile minimum teması olduğundan emin olun, böylece çözeltiyi birden çok ardışık küçük damlacıklar halinde uzun aralıklarla sürekli çözelti çıkarma işleminde çıkarır. Ardından, perifüzyonu 3 milimolar glikoz içeren görüntüleme solüsyonu ile başlatın ve yeşil floroforları görüntülemek için ışık yolunu ve filtreleri seçin. Ardından, görüntüleme parametrelerini ayarlamak için canlı görüntülemeyi çalıştırın ve ilgilenilen adacıkları yakalamak için görünümü ayarlayın.

Görüntünün sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, uyarma ışığı yoğunluğunu, pozlama süresini ve gruplamayı ayarlayın ve ayarların adacıklar içindeki her hücrenin mümkün olan en düşük ışık yoğunluğu ve pozlamada farklı bir şekilde görüntülenmesine izin vermesini sağlayın. Ardından, adacıkları 0,1 ila 5 Hertz arasında görüntüleyin ve elde edilen verilerin yakalanırken kalitesini kontrol edin.