Primer Acinar Hücre İzolasyonu: Acinar Hücreleri Fare Pankreasından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

- Pankreas asiner hücresi, çeşitli sindirim enzimleri içeren bir ekzokrin hücredir. Bazen, onkojenik sinyallemeye yanıt olarak, asiner hücre bir duktal hücreye dönüşür. Bu duktal hücre daha sonra kanserli hale gelebilir. Bu nedenle, pankreas kanserinin ilerlemesindeki rollerini incelemek için asiner hücreleri izole etmek hayati önem taşır.

Pankreası ötenazi yapılmış bir fareden izole ederek başlayın. Pankreası, bir antibiyotik ile desteklenmiş dengeli bir tuz çözeltisi içeren bir tartı teknesine ekleyin. Pankreası makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın ve pankreas dokusunu bir tüpe ekleyin. Daha sonra, tüpteki pankreas parçalarına kollajenaz çözeltisi ekleyin.

Kolajenaz, dokuyu bir arada tutan kolajeni sindirir, böylece doku ince parçalara ayrılır. Şimdi, tüpe serum içeren ortam ekleyin ve dokuyu buzun üzerine yerleştirin. Bu, kollajenazın etkisini durdurmaya yardımcı olur.

Dokuyu ve ortamı iki kez filtreleyin, ince doku süspansiyonu elde etmek için her seferinde filtrenin ağ boyutunu kademeli olarak azaltın. Son olarak, peletteki asiner hücreleri toplamak için elde edilen süspansiyonu santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve daha fazla analiz için asinar hücreleri saklayın. Aşağıdaki protokolde, ötenazi uygulanmış bir farenin pankreasından asiner hücreleri izole edeceğiz.

- Pankreası ötenazi yapılmış bir fareden çıkarmak için, önce farenin pençelerini polistiren kapağa sabitleyin, kuyruğu araştırmacıya bakacak şekilde yönlendirin ve karına% 70 etanol püskürtün. Orta hatta kürk ve deriyi kaldırmak için otoklavlanmış forseps kullanın ve otoklavlı makasla üretral açıklıktan diyafram-göğüs kafesi bölgesine kadar kürk ve deriden bir kesi yapın. Karın boşluğunun net bir görünümünü oluşturarak kürkü ve cildi kesmek için sola ve sağa ek kesiler yapın.

Daha sonra periton zarını ortadan ve sağa ve sola kesin ve organlardan uzaklaştırın. Bağırsakları kaldırmak için forsepsleri kullanın ve farenin sol tarafına hareket ettirin, koyu kırmızı oval dalağa bağlı açık pembe pankreası görmek için alan yaratın. Pankreas dokusu yumuşak, süngerimsi bir dokuya sahip olacaktır. Mide boyunca uzanan ve bağırsaklarla iç içe geçen pankreası kesin.

Dalağı pankreastan ayırın ve pankreası 1X penisilin-streptomisin içeren 10 mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve laminer akış başlığına aktarın. Tüpün içindekileri boş bir tartı teknesine dökün ve pankreası döndürerek yıkamak için forseps kullanın. Daha sonra pankreası penisilin-streptomisin içeren HBSS içeren ikinci bir tartı teknesine taşımak için forseps kullanın ve döndürerek tekrar yıkayın.

Pankreası penisilin-streptomisin içeren HBSS içeren üçüncü tartı botuna taşıyın ve pankreası 5 milimetre veya daha küçük parçalar halinde kesmeye başlayın. Tartı teknesinin içindekileri 50 mililitrelik yeni bir tüpe dökmek için, tekne devrilirken pankreas parçalarını sıvıya hareket ettirmek için önce forsepsleri kullanın. Parçalar artık tekneye bağlı olmadığında, içindekileri tüpe dökün. Kalan parçaları forseps ile toplayın ve forsepsleri tüpte yıkayın.

Tüpü iki dakika boyunca 4 santigrat derecede 931 kez yerçekiminde santrifüjledikten sonra, HBSS'yi ve yüzen yağları çıkarmak için 5 mililitrelik bir pipet kullanın. HBSS'de seyreltilmiş 5 mililitre kollajenaz ekleyin. Tüpü kapatın ve tüpü plastik parafin filme sararak kapalı bir kapak sağlayın. Bir inkübatöre yerleştirin, 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede 220 RPM'de çalkalayın, bu da bulanık bir çözelti ve birkaç doku parçası bırakacaktır.

Ayrışmayı durdurmak için, tüpü buzun üzerine yerleştirin ve% 5 FBS ile 5 mililitre soğuk HBSS ekleyin. İki dakika boyunca 4 santigrat derecede 931 kez yerçekiminde santrifüjledikten sonra, süpernatanı 5 mililitrelik bir pipet kullanarak çıkarın. Pelet% 5 FBS ile 10 mililitre HBSS'de yeniden süspanse edin ve 4 santigrat derecede iki dakika boyunca 931 kez yerçekiminde tekrar santrifüjleyin.

5 mililitrelik bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve bu adımı% 5 FBS içeren 10 mililitre HBSS ile tekrarlayın. Daha sonra peleti% 5 FBS ile 5 mililitre HBSS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir seferde 1 mililitre filtrelemek için bir P1000 pipeti kullanın, 500 mikrometrelik bir ağdan 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Kalan pankreas hücrelerini ağdan yıkamak için,% 5 FBS ile 5 mililitre HBSS ekleyin. Daha sonra bu süzüntüyü 105 mikrometre ağdan her seferinde 1 mililitre geçirmek için bir P1000 pipeti kullanın, 50 mililitrelik bir tüpe geçirin. Bu hücre süspansiyonunu, üstte bir hücre süspansiyonu tabakası oluşturacak olan% 30 FBS ile HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe nazikçe pipetleyin.

Bu hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca 4 santigrat derecede 233 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Asiner hücreleri içeren peleti 1X Waymouth'un tam ortamında yeniden süspanse edin.