Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

- Pankreastaki adacık hücreleri, endokrin fonksiyonlarda rol oynayan temel hormonları üretir. Adacıkları izole etmek için önce ötenazi yapılmış bir fareyi emniyete alın ve karın boşluğunu cerrahi olarak ortaya çıkarın. Ortak safra kanalını bulmak ve klemplemek için karaciğeri ve bağırsakları bir kenara fırçalayın. Pankreas ve safra kanallarının birleşmesiyle oluşan kanal olan Vater'in ampullasını tanımlayın.

Daha sonra, ortak safra kanalına bir kollajenaz enzim çözeltisi enjekte edin. Kanaldan gelen geri akış, pankreası başarılı bir şekilde şişirerek pankreas dokularının kollajenaz kaynaklı ayrışmasını kolaylaştırır. Pankreası daha fazla kollajenaz çözeltisi içeren bir tüpe eksize edin. Dokuyu mekanik olarak doğrayın ve kollajenaz tarafından doku sindirimine yardımcı olmak için inkübe edin.

Homojen bir süspansiyon elde ettikten sonra, kollajenaz aktivitesini inhibe eden proteinler içeren bir çözelti ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Bir doku peleti toplamak için santrifüjleyin. Peleti uygun yoğunluklu gradyan bir ortamda yeniden süspanse edin, üzerine uygun bir tampon yerleştirin ve gradyan katmanları oluşturmak için santrifüjleyin.

Yoğunluk gradyan ortamı ile tampon arasında oluşan katmandan adacıkları toplayın. Son olarak, kültür için sağlıklı adacıklar seçin. Aşağıdaki protokolde, murin pankreas adacıklarının kollajenaz uygulaması ile izolasyonunu ve ardından yoğunluk gradyan santrifüjünü göstereceğiz.

- Farenin uzuvlarını sırtüstü pozisyonda bantlayarak ve vücuda% 70 etanol püskürterek başlayın. Kapak camı forseps ve kavisli cerrahi makas kullanarak, yaklaşık 3 santimetrelik yatay bir karın derisi kesisi yapın ve karın duvarını ortaya çıkarmak için cildi çekerek açın. Pankreası tamamen ortaya çıkarmak için karın peritonu üzerinde 3 ila 4 santimetrelik dikey bir kesi yapın ve fareyi diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

Soluk, pembe bir tüp gibi görünen safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğer lobunu üst tarafa itin ve safra kanalını ve hepatik arteri ortaya çıkarmak için bağırsakları sağ lomber ve iliak bölgeden karın boşluğunun sağına doğru nazikçe hareket ettirin. Ortak safra kanalını karaciğere mümkün olduğunca yakın bir şekilde dikkatlice klemplemek için Schwartz Micro Serrefines'i kullanın ve duodenal papillada bulunan ve pankreas kanalı ile ortak safra kanalının birleşmesiyle oluşan Vater ampullasını tanımlayın.

Ortak safra kanalını gergin çekmek için Mikro Adson forseps kullanarak, 3 mililitre taze hazırlanmış kollajenaz P çözeltisi içeren 3 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 30 gauge yarım inçlik bir iğneyi Vater'in ampullasına sokun ve iğneyi damarın uzunluğunun yaklaşık dörtte biri boyunca damara paralel kanala itin. İğne yerine oturduktan sonra, iğneyi Micro Adson forseps ile stabilize edin ve kanala yavaş ve düzenli bir şekilde 3 mililitre kollajenaz P solüsyonu enjekte edin. Pankreasın baş, boyun, gövde ve kuyruk bölgeleri tamamen şişirilmişse enjeksiyon başarılı kabul edilir.

- Ampullaya uygun giriş ve ortak safra kanalının kanülasyonu, başarılı bir sindirim hasadı için kritik öneme sahiptir. Kanal duvarlarının delinmesi izolasyonun etkinliğini azaltır.

- Kavisli ve Mikro Adson forsepsleri kullanarak, şişirilmiş pankreası dalaktan başlayıp mideye doğru ve duodenum boyunca dikkatlice dışarı çekin. Daha sonra pankreası 3 mililitre buz gibi soğuk kollajenaz P çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir sindirim tüpüne yerleştirin. Adacıkları hasat etmek için, önce tüpü 12 ila 13 dakika boyunca dakikada 100 ila 120 dönüşte 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirmeden önce pankreası 3 ila 5 saniye doğramak için ince cerrahi makas kullanın.

İnkübasyonun sonunda, ince, kum benzeri pankreas dokusu parçacıkları tarafından onaylandığı gibi, çözelti homojen olana kadar dokuyu bozmak için tüpü yaklaşık 30 saniye boyunca hafifçe sallayın. Doku sindirilir sindirilmez, tüpü buzun üzerine yerleştirin ve enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için 40 mililitre buz gibi soğuk durdurma çözeltisi ekleyin. Peleti nazikçe parçaladıktan sonra, sindirim dokusunu sallanan bir kova santrifüjünde döndürün ve ardından yıkama başına 20 mililitre taze durdurma solüsyonu ile iki santrifüj yapın.

Son yıkamadan sonra, peleti üç ek yıkama için 40 mililitre buz gibi HBSS'de yeniden süspanse edin, son yıkamadan sonra peleti 5 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyan çözeltisinde yeniden süspanse edin. Tüpe 5 mililitre daha oda sıcaklığında yoğunluk gradyanı eklemeden önce, çözelti homojen hale gelene kadar tüpü düşük hızda kısa bir süre vorteksleyin. Şimdi, bir gradyan oluşumuna izin vermek için tüpe 10 milimetre oda sıcaklığında HBSS'yi damla şeklinde nazikçe ve yavaşça eklemek için 10 milimetrelik bir pipet kullanın ve hücre popülasyonlarını yoğunluk gradyanı ayrımı ile izole etmek için sallanan bir kova santrifüjü kullanın.

Santrifüjlemenin sonunda, yoğunluk gradyanı ile HBSS arasındaki adacık tabakasının 5 ila 10 mililitresini toplamak için soğuk HBSS ile önceden ıslatılmış 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Adacıkları 20 mililitre taze, buz gibi soğuk HBSS içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri sallanan bir kova santrifüjünde santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatantın son 3 mililitresi hariç hepsini peleti rahatsız etmeden dikkatlice aspire edin ve adacıkları yıkama başına 20 mililitre taze HBSS ile en az üç kez daha yıkayın.

Son yıkamadan sonra, süpernatanı 4 mililitre 37 santigrat derece RPMI 1640 ortamı ile değiştirin ve peleti çıkarmak için tüpü hafifçe döndürün. Adacıkları hemen 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve kalan adacıkları toplamak için tüpü 5 mililitre taze RPMI 1640 ortamı ile yıkayın ve yıkamayı diğer adacıklarla birlikte toplayın.

Daha sonra, 10 mililitre tam RPMI 1640 ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarmak için Petri kabından pürüzsüz bir yüzeye sahip sağlıklı küresel veya dikdörtgen, altın-kahverengi adacıklar almak için bir diseksiyon mikroskobu ve 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Tüm adacıklar toplandığında, adacıkları gece boyunca nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte steril inkübatöre yerleştirin.