Sferoidlerin İmmünofloresan Boyanması: Hücre İçi ve Hücre Dışı Antijen Ekspresyonunun Ekspresyonu için Spheroidleri Analiz Etme Tekniği

- Sferoidler, üç boyutlu in vitro hücre kültürü modelleridir. İmmünofloresan boyama için, önce çok kuyulu bir plakada gerekli hücre tipinde bir küresel kültür oluşturun. Geniş delikli bir ucu olan bir mikropipet kullanarak, kesme kuvvetleri nedeniyle yırtılmayı önlemeye dikkat ederek sferoidleri toplayın.

Ardından, tek tek hücreleri geçirgen hale getirmek için sferoidleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin. Şimdi, hücre yüzeyindeki spesifik olmayan protein etkileşim bölgelerini bloke etmek için proteinler içeren bir çözelti ile inkübe edin. Sferoidleri istenen bir birincil antikor kokteyli ile tedavi edin. Antikorların hücre yüzeyindeki hedef moleküllere bağlanması için inkübe edin.

Daha sonra, sferoidleri, birincil antikorlara özgü floresan etiketli bir ikincil antikor çözeltisi ile etiketleyin. Son olarak, hücre çekirdeklerini boyamak için sferoidlere uygun bir floresan DNA bağlayıcı boya uygulayın. Lazer taramalı bir floresan mikroskobu kullanarak, sferoidin çoklu optik kesitlerini farklı optik düzlemlerde görüntüleyin.

Yakalanan görüntüler, floresan etiketli çekirdekleri ve ilgilenilen antijenleri yansıtır. 3B sferoidin son bileşik görüntüsünü elde etmek için ilgili yazılımı kullanarak yığınları birleştirin. Aşağıdaki protokolde, bir uyarıcı olan TGF beta 1 varlığında kültürlenen pankreas fibroblastlarının ve kanserle ilişkili fibroblastların sferoidlerinin immünofloresan boyamasını gerçekleştireceğiz.

- İlk olarak, deliği büyütmek için bir pipet ucunun ucunu kesin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, sferoidleri deneysel koşul veya analiz edilecek protein başına 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne toplamak için bu kesilmiş pipet ucunu kullanın. Sferoidleri yaklaşık 30 ila 60 saniye boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatan içeren metilselülozu pipetleme yoluyla dikkatlice çıkarın ve peletlenmiş sferoidleri rahatsız etmemeye dikkat edin.

- Sferoidler reaksiyon tüplerine aktarılırken özel dikkat gösterilmelidir. Ucu keserek kesme gerilimi kuvvetlerine sahip olmadığınızdan emin olun. Tüm sferoidleri toplamanız da önemlidir. Yıkama aşaması sırasında, sferoidleri aspirasyon ile kaybetmediğinizden emin olun.

- Sferoidleri 50 mikrolitre 1X PBS'de yıkamak için, 30 ila 60 saniye boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin, ardından PBS'yi pipetleyerek dikkatlice çıkarın. Boyanacak proteine bağlı olarak, sferoidleri 50 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile PBS'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sabitleyin.

Sferoidleri daha önce tarif edildiği gibi PBS ile yıkayın. Hücreleri PBS'de% 0.1 Triton X ile oda sıcaklığında 4 dakika geçirgen hale getirin. Ardından, sferoidleri daha önce tarif edildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın. Sferoidlere %5 FBS ve %2 BSA içeren PBS ekleyin ve spesifik olmayan protein etkileşim bölgelerini bloke etmek için oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Şimdi, sferoidleri gece boyunca 4 santigrat derecede %2.5 FBS ve %1 BSA ile PBS'de 30 mikrolitre primer antikor ile inkübe edin. Ertesi gün, sferoidleri daha önce tarif edildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın.

Bundan sonra, sferoidleri 90 dakika boyunca oda sıcaklığında% 2.5 FBS ve% 1 BSA ile PBS'de 30 mikrolitre ikincil antikor ile inkübe edin. Sferoidleri PBS'de daha önce tarif edildiği gibi üç kez yıkayın.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 30 mikrolitre DAPI boyama çözeltisi ile inkübe edin. Sferoidleri daha önce açıklandığı gibi PBS'de bir kez yıkayın. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, sferoidleri bir damla PBS'de bir cam slayt üzerine yerleştirin. Sferoidleri 10 kat büyütmede floresan mikroskobu ile görüntülemek için bir lazer tarama mikroskobu kullanın. Bir Z yığınının farklı optik düzlemlerinde sferoidin farklı optik kesitini alın.