JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:41 dk. • April 30th, 2023
- Manyetik biyobaskılı 3D ko-kültürlerde, çoklu hücre tipleri manyetik alanların etkisi altında 3D yapılar veya sferoidler oluşturur. Kültürü kurmak için önce kanser hücrelerinin ve fibroblastların tek hücreli süspansiyonlarını uygun ortamlarında hazırlayın. Ardından, her iki süspansiyona da biyouyumlu manyetik nanopartiküller ekleyin. Bu nanomalzemeler, manyetik parçacıkların elektrostatik etkileşimler yoluyla hücre zarına spesifik olmayan bağlanmasını kolaylaştıran pozitif yüklü poli L-lizin kalıntıları içerir.
Kanser hücrelerinin ve fibroblastların maksimum manyetizasyonunu elde etmek için inkübe edin. Daha sonra, her iki hücre süspansiyonunu istenen oranda karıştırın. Bu hücre-nanopartikül süspansiyonunu, hücre yapışmasını önlemek için özel olarak optimize edilmiş, hücre itici bir kültür plakasına aktarın. Bu kurulumu manyetik bir sürücüye monte edin ve inkübe edin. Manyetik kuvvetler, manyetize kanser hücrelerinin ve fibroblastların kuyu dibindeki 3D küresel yapılara toplanmasını veya biyo-basılmasını yönlendirir.
Sferoidler oluştuktan sonra, mıknatısı çıkarın ve 3D ko-kültürlerin istenen hacme ulaşmasına izin verin. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinden ve PS1 ile aktive olan pankreatik fibroblast hücrelerinden manyetik biyobaskı tekniği kullanılarak üç boyutlu ko-kültür sferoidlerinin oluşturulmasını göstereceğiz.
Standart aseptik doku kültürü tekniğini kullanarak, ilgilenilen kanser hücrelerini ve fibroblastları T75 şişelerinde uygun büyüme ortamında kültürleyin. Hücreler% 70 ila% 80 birleşmeye ulaştığında, kültürleri 5 mililitre PBS'de bir kez yıkayın ve hücreleri, 37 santigrat derecede beş dakika boyunca şişe başına 2 mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ile şişe yüzeylerinden ayırın.
Mikroskop altında ayrılmayı onayladıktan sonra, Tripsin'i şişe başına 8 mililitre büyüme ortamı ile devre dışı bırakın. Ve sayma için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için hücreleri birkaç kez pipetleyin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri taze büyüme ortamında mililitre konsantrasyonlarında 1 kez 10 ila altıncı hücrelerde yeniden süspanse edin.
Hücreleri manyetize etmek için, 100 mikrolitre hücre başına büyüme ortamına 10 mikrolitre NanoShuttle ekleyin ve çözeltileri hafifçe çalkalayın. Tüpleri birkaç kez nazikçe ters çevirin ve hücre-NanoShuttle karışımlarını 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. NanoShuttle'ın hücre yüzeyine bağlanmasını kolaylaştırmak için hücreleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak iki saat inkübe edin. Bağlanma inkübasyonunun sonunda, her bir manyetize hücre süspansiyonunu pipetleme ile nazikçe karıştırın ve konsantrasyonu 150 mikrolitre ortam başına 1.5 kez 10 ila dördüncü manyetize kanser hücrelerine veya fibroblastlara ayarlayın.
Fibroblast ve kanser hücrelerini, oyuk başına toplam 150 mikrolitre tohumlanmış hücre için 2'ye 1 oranında karıştırın. Hücre itici, 96 oyuklu plakayı, daha ince mıknatıslara sahip 96 oyuklu bir manyetik küresel sürücünün üzerine yerleştirin ve her bir oyuğa 150 mikrolitre hücre karışımı tohumlayın. Tüm hücreler kaplandığında, plakayı manyetik sferoid sürücü hala takılıyken gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ertesi sabah, manyetik sürücüyü çıkarın ve hücreleri yedi güne kadar daha inkübatöre geri koyun.